小鼠β-actin+mRNA荧光定量PCR方法的建立.pdfVIP

中国畜牧兽医 2011年第38卷第7期 生物技术 ·127· mRNA荧光定量PCR方法的建立 小鼠I$-actin 唐佳佳，岳华，杨发龙。汤承 (西南民族大学生命科学与技术学院，四川成都610041) 摘要：本研究旨在建立定量检测小鼠8．actinmRNA表达水平的实时荧光定量PCR方法，为小鼠相关基因表达水平的分 Green 析提供方法。根据GenBank中登录的小鼠伊actinmRNA序列，针对保守区域设计并合成1对引物，建立了基于SYBR I技术的小鼠p-actin 基因用于小鼠相关基因转录水平分析提供了基础。 关键词：小鼠；B-aetin基因；实时荧光定量PCR 中图分类号：Q503 文献标识码：A 文章编号：1671—7236(2011)07—0127-03 荧光定量PCR(real—timePCR)因其对核酸分定量分析中的内参基因，已经在人和多种动物中建 PCR 子定量准确、特异性高、灵敏度高和重复性好的特 mRNA的反转录real—time 立了检测[3-aetin 点，已成为定量分析tuRNA表达水平最广泛使用的(RRT．PCR)方法。小鼠是最常用的试验动物之一， 的技术之一(Kubista等，2006；Bustin等，2004，本研究建立了检测小鼠伊actinmRNA的RRT— 2005)。Real-timePCR技术是在PCR反应系统中PCR方法，为采用real—timePCR方法对小鼠相关 引入了荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个 基因转录水平的研究提供有用的方法。 PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量 1材料与方法 分析的方法(Morlan等，2009)，分为绝对定量和相1．1材料 对定量。绝对定量是用标准曲线来检测未知样本的 1．1．1试验动物成年昆明小鼠，购于四川省实验 精确拷贝数；相对定量是检测未知样本间基因表达 动物养殖基地。 的差异。相对定量要求不同组织和细胞样本中起始 1．1．2 主要仪器 实时荧光定量PCR仪ABI 模板数量、RNA的完整性和提取效率、cDNA合成酶 的有效性和PCR扩增效率、转录活性等参数都相同 梯度PCR仪Hybaid (Bustin，2002；Ginzinger，2002)，分析结果才真实可外分光光度计Beckman 靠。但实际上这些参数不可能完全相同，因此选择一 国)；高速冷冻离心机(Eppendorf公司，德国)。 个在不同发育水平和不同组织类型中都稳定表达的 1．1．3 主要试剂TaqDNA聚合酶、SYBR Ex 看家基因作为内参，与目的基因同时检测，对目的基 Premix TaqTM、Trizol 因的检测结果进行校正，从而真实反映目的基因的表 pMDl9一T 达量(Zhang等，2005；Neuvians等，2005)。p-actin基ExtractionMini 公司；Gel Kit购自上海华舜生物工 因编码的伊肌动蛋白是细胞骨架的主要成分，存在于 MiniKit Plasmid 程有限公司，