小鼠肝核仁体外转录的研究.pdfVIP

遗传 HEREDITAS心Beijing) 3(4): 11-141981 小鼠肝核仁体外转录的研究 韩玉现 张玉瑛 陈德高 （中国科学院生物物理研究所二室，北京） 真核细胞基因的表达及其调控是当前分子 液 (（1克肝重加1毫升）于玻璃匀浆器中匀浆。 生物学领域中极为重要的研究课题之一，尤其 四层纱布过滤，将滤液离心 3（,500-4,000r.p. 是特定基因的表达与调控更加引人注意。真核 m)15分钟，得粗制的细抱核沉淀。将粗制细 细胞的核仁是核搪体装配的场所，它含有多拷 胞核悬浮于 2.3M 蔗糖-lOmMMgCl2溶液中 贝的特定基因— 核糖体RNA基因 r（DNA) (1克肝重加1毫升），略加匀浆，离心 （17,000r. 和专门负责转录 rDNA的 RNA聚合酶I，唯 p.m)1.5小时，得纯净的细胞核沉淀。再将细 一的基因产物是 rRNA。因此，核仁及其染色 胞核悬浮在 0.34M 蔗糖-0.05mMMgC12溶液 质是研究特定基因转录及其调节控制的一个理 中 （1克肝重加1毫升），用超声波发生器 英（国 想系统。Busch等14〔1于1964年第一次证明离 MSE型，振幅6微米）破碎细胞核。将超声悬 体核仁能在体外系统中合成rRNA。其后，不少 液铺在等体积的0.88M蔗糖-0.05mMMgC1，溶 工作者分别用鼠肝细胞U［,151、蛙卵母细胞81〔、四 液上，离心 3（,700r.p.m)20分钟，得到核仁沉 膜虫细胞51〔，以及多种人工培养细胞 (Novikoff 淀，并再重复一次。以上操作均在4℃进行，并 肝癌细胞、Hela细胞、Ehrlich腹水癌细胞 用光学显微镜检查核及核仁纯度。把沉淀的核 等）[11,121的核仁及其染色质对rRNA的体外合 仁悬浮于一定体积的10mMtris-HCI(pH7.4)- 成进行了研究。我们以小鼠肝核仁为材料，研 50务甘油一0.1mMEDTA溶液中，于一80℃保 究核仁染色质的结构与功能，试图寻找与rRNA 存备用。 体外合成有关的某种调控蛋白，以便阐明真核 化学组成分析 核仁 DNA,RNA、蛋 细胞核糖体基因表达的调控机理。 白质的分离抽提按Sinelai：等人11［3的方法进行。 DNA,RNA、蛋白质的测定分别按 Burton133, 材 料 和 方 法 Schjeidell6，和Lowry[103方法进行。 实验动物为成年小白鼠。ATP,CTP,UTP 转录活性测定 反应总体积。.15毫升， 系中国科学院上海生物化学研 究所 东风厂产 其中含 tris-HCI(pH7.9)33mM,MgC1Z25mM, 品。[3H]-GTP(30居里／毫克分子）系上海原 KC150mM,DTT6.6mM,ATP,CTP,UTP皆 子能研究所产品。a-鹅膏覃碱 (a-amanitin)系 为0.66mM,GTP0.015mM,[3H卜GTP1微居 BoehringerMannheimGmbh产品。肝素钠系郑 里，核仁悬浮液20微升相（当于40微克DNA), 州畜产综合加工厂产品。 放线菌素D系英国 甘油最终浓度为20%。反应液于37℃保温 15 BDH产品。 分钟，在冰水浴中终止反应。用纸片法测酸不 核仁的分离 参照 Higashinakagawa等 溶产物放射性并计数。空白对照，上述反应液 人刀‘的方法，并略加修改。成年小鼠，预先饥饿 中缺少三种非放射性的三磷酸核普，或缺少核 15小时以上。断头处死，取肝，在冰冷的。.25M HanYuminetal.:InvitroTranscriptionResearchof 蔗糖-1Ommmgc12溶液中洗涤。加上述蔗糖溶 Isolated Nucleolusfrom M ouseLiver