DNA改组技术及其在蛋白类药物定向进化中的应用.pdfVIP

维普资讯 中国药物与临床2008年8月第8卷第8期ChineseRemediesClinics，August2008，Vo1．8，No．8 · 589 · ． ；争 DNA改组技术及其在蛋白类药物定向进化中的应用 李奇璋 黄 蕾 周选围 唐克轩 自DNA重组(DNAshuffling)技术诞生以来，作 次的退火过程中，引物都与不同的模板结合，延伸。 为现代生物技术核心的基因工程技术得到了飞速的 它采用变换模板的方式，简便而有效，为酶的体外定 发展．特别是改组技术在基因重组，分子、蛋 白蛋进 向进化又提供了一个强有力的方法。 化等领域得到了快速的发展，开创 了定向分子进化 1．1．2 基因家族改组：基因家族改组 (genefamily 的新纪元。和常规进化相比，定向进化具有快速、高 shuffling)是指把具有相似功能的一组基因，通过改 效的特点。比随机诱变显著地提高了良性突变的概 组技术定向进化。1998年 Crameri等[4_以序列同源 率，且改组技术的方法巧妙，重点突出，着重实效，能 性为58％～82％的四种头孢菌素酶C基因为实验材 够在几年甚至几天内完成对特定基因的进化改造， 料。当分别 以这 四种基因为改组底物进行DNA改 满足人们的需求。虽然随机突变、盒式突变以及同源 组，其抗性增强了8倍：而以这四种基因共同作为底 重组等都能够达到体外定向进化的目的，但是以 物进行改组时，其抗性提高了270倍 (和野生型的 DNA重组技术为基础的DNA改组技术能够获得更 enterobacter，citrobacter基因相比)到540倍(和野生 加多样性的突变文库及更高的适应性_l_。 型klebsiella，yersinia基因相比)。最佳的克隆包含 了 1 DNA改组技术 四种底物基因中三种基因的8个片段，以及有33个 DNA改组，又称有性聚合酶链反应 sexual 氨基酸位点的突变。在 自然界的进化过程中，物种之 PCR)，是指DNA分子的体外重组，是基因在分子水 间的遗传信息的交换是受到限制的。而基因家族改 平上进行的有性重组 sexualrecombination)。通过 组技术打破了这种限制．实现了单基因在不同物种 DNAshuffling技术，既可对单基因或DNA片段进行 中的遗传信息交换。 改组，也可对基因组或染色体等进行改组[2]。 通常，在DNA改组的过程 中，使用的是双链的 1．1 单基因或DNA片段的改组 DNA (doublestrandedDNA，dsDNA)作为底物 。 1．1．1 交错延伸过程的改组：所谓交错延伸(stagger Kikuchi等[]以单链DNA (singlestrandedDNA SS— extensionprocess，StEP)，是指在PCR反应中把常规 DNA)代替dsDNA作为底物进行改组实验。他们以 的退火和延伸合并为一步，通过极简短的退火．与不 两种儿茶酚2，3一双氧酶(catechol2，3-dioxygenase) 同的模板不断地延伸，直到形成全长子链。由于每次 基因nahH和xylE作为实验对象。当nahH和xylE 退火都和不同的模板配对，因此在合成的子链中包 经过SSDNA改组后，其嵌合率达到了14％，远远高 含了不同的亲本的遗传信息，从而显示出新的遗传 于dsDNA改组的 1％的嵌合率，并且其基因产物 特征。1998年，Zhao等[3_利用该方法，对枯草杆菌蛋 NahH和XylE有更高的热稳定性。同时，他们认为单 白酶E基因定向进化。通过一轮易错PCR和