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PCR技术的应用与微生物系统进化研究的发展 陈 敏 分类和进化研究是生物学中最古老的领域之一。过去的研究主要依靠生物体的形态，并辅以生理 特征，来探讨生物间亲缘关系的远近，有人称之为经典的方法，它是一百多年来完成微生物分类的主 要方法。经典的方法是随机的和不系统的，只适用于一些形态复杂的真核生物和较大的原核生物。现 在，由于生物技术的不断完善，人类对自然界的认识水平不断地提高，就对以前的一些研究方法以及 研究结果提出了质疑。如长久以来，生物界被划分为原核、真核两大界，认为真核生物由原始的原核 生物进化而来。但随着对原核生物各类群的研究的深入，却发现许多生活在极端环境(高盐、高温、极 端pH值)的古细菌(Archaebacteria)在生理生化诸多方面与一般的真细菌存在巨大差异，其分子机制 亦相当独特。那么，这类古细菌是否应当从原核生物中独立出来而自成一个体系呢？近年来，由于分 子生物学的迅速发展和广泛应用，特别是蛋白质和核酸序列研究的突破性进展，使微生物系统分类的 基础发生了重大的变化，分类系统已经或正在随着分子标准的不断渗入而完善。所谓分子标准主要是 指建立在DNA分析技术基础上的分类方法。与表型特征相比较，核酸序列在生物体的进化过程中较少 受到环境的影响，因而更能反映出生物体在演变进化过程中的本质，其研究结论也更可靠。这样，人 们就将系统进化研究从宏观逐渐转向微观，并把宏观和微观的特征结合起来，以便更准确地反映生物 体间真正的进化关系。 早期的分子标准主要建立在诸如DNA碱基比例测定或核酸分子杂交等基础上。我们知道，每一种 生物体均有其特有的、稳定的核酸成分和结构；不同生物间核酸成分和结构的差异程度代表着它们之 间亲缘关系的远近。由此，从核酸分子水平来研究生物的进化关系就成为分类学的一个新途径，微生 物分类学也不例外。最早在1956年由Lee等提出了DNA碱基比例的测定方法。DNA碱基比例主要是指 “G+Cmol％”比例，即鸟嘌呤(G)和胞嘧啶(C)在整个DNA中的摩尔百分比。不同种的微生物，其4种 碱基的含量及排列顺序不同，因此G+Cmol％比例一般会随种的不同而有变化。一般来说，G+Cmol％差 异愈大，分类地位愈疏远。而G+Cmol％比例相似，可能属于同种，也可能不是同种，因为碱基成分相 似的DNA可能有很多种碱基顺序。例如，螺菌属(Spirillum)的G+Cmol％比例是38％～65％，辐度过 宽。后来根据其碱基成分和其他特征的不同已被划分成3属：螺菌属(Spirillum，38％)、海洋螺菌属 (Oceanspirillum，42％～48％)和水生螺菌属(Aquaspirillum，50％～56％)。 如前所述，测定DNA的G+Cmol％比例只能确定含量不同的细菌为不同的种，而不能确定含量相近 的细菌必然属于同一个种。若要进一步确定，还必须借助其他方法，例如核酸分子杂交方法。研究 DNA-DNA或DNA-RNA杂交最方便的方法，就是采用来自一个菌株的放射性核酸与来自另一个菌珠的非 放射性核酸，经热变性之后，把两种核酸样品混合，使其复性，测定放射性结合键的百分率。百分率 越高，说明两者碱基顺序的同源性越高，亦即亲缘关系越近。核酸分子杂交技术对解决种水平上的分 类学问题和确定新种是十分有效的。 16 16 从20世纪70年代初起， SrRNA序列分析成为细菌分类的一个重要指标。 SrRNA分子具高度的 保守性，在30多亿年的进化中仍保持着原初的状态，因此可用作探索自古至今生物的主要进化历程， 16 18 是一种理想的研究材料。1977年，Woese等人测定了200多种原核生物的 SrRNA和真核生物的 SrRNA 的寡核苷酸顺序谱，经比较研究，不但搞清了原核生物和真核生物的许多系统进化问题，而且还以此 为根据提出了生命体系的三界学说，引起了生物学家的普遍关注，并由此而引发了研究古细菌的热潮。 16SrRNA寡核苷酸顺序分析所依据的基本原理是这样的，用可专一性地水解G(鸟嘌呤)上3′端磷酸酯 service@100