QRT-PCR检测目的基因mRNA转录水平的应用.pdfVIP

安徽农业科学。JournalofAnhuiAgri．Sei．2011，39(30)：18432—18434 责任编辑 郑丹丹 责任校对 傅真治 QRT．PCR检测 目的基因mRNA转录水平的应用 韩天龙，王敏，李志明 (内蒙古自治区赤峰市农牧科学研究院，内蒙古赤峰024031) 摘要 [目的]详细介绍OneStepSYBRGreenI实时荧光定量聚合酶链式反应(Real—timeQuantitativeReverseTranscriptionPo)ymerase ChainReaction，简称 QRT．PCR)在定量检测靶基 因mRNA转录水平上的应用。[方法]从样品准备、引物设计、核酸提取、反应体系构建、 反应条件确定、标准曲线建立和 目的基因定量等方面进行了分析。[结果]决定QRT—PCR反应成功与否的几个关键因素有模板的质量、 底物的质量与浓度、引物的质量、酶和Mg“、反应条件的优化。[结论]为畜牧兽医工作者利用分子生物学技术揭示疫病的发生机制和 发病机理提供了技术参考，为基因表达的相对定量研究提供了方法支持。 关键词 QRT—PCR；荧光定量；基因表达；转录水平 中图分类号 S188 ．1 文献标识码 A 文章编号 0517—6611(2011)30—18432—03 ApplicationofQRT-PCRintheDetectionofmRNATranscriptionLevel I NTian-longetal (ChifengAcademyofAgricultureandAnimalHusbandrySciences，Chifeng，InnerMongolia024031) Abstract O『bjective]TheapplicationofOneStepSYBRGreenIQRT．PCR(Real—timeQuantitativeReverseTranscriptionPolymeraseChain Reaction)inthequantitativedetectingthemRNAtranscriptionleveloftargetgenewasintroduced．[Method]Thesamplepreparation，primerde— sign，RNA extraction，reactionsystem establishment，standradcurvebuildingandquantitativegeneexpressionduringtheprocedurewereanalyzed． [Result] efollowingfactors：thequalityoftemplatequality，thequalitynadconcentrationofsubstrate，thequalityofprimer，enzymeandMg“， andreactionconditionwaskeypointintheSuccessoftheQRT—PCR．[Conclusion]卟ereferenceforthepathogenesisrevealingofanimaldisease withmoleculra biologytechnologywasprovided． Keywords QRT-PCR；兀uorescentquantity；Geneexpression；Transe~ption1evel PCR技术是现代分子生物学研究中应用最广泛的技术 3 总RNA的提取 之一，于 1983年由美国科学家Mullis首创，1993年获得诺贝 尽量避免内源性和外源性RNA酶污染是防止 RNA降 尔化学奖。1996年推出实时荧光定量聚合酶链式反应 (Re— 解的最有效途径。试验用具及耗材要经 0．1％DEPC水处理 al--timeQuantitativeReverseTranscriptionPolymeraseChainRe-· 或高压灭菌。用氯仿分离除去DNA和蛋 白质。高蛋 白、高 action，简称 QRT—PCR)技术 ，通过荧光强度变化监测扩增产 脂肪或多糖类组织，在匀浆或液氮研磨后于4℃下 12000g 物量的变化。其优点是灵敏陛好、精确度高、污染小，尤其是 离心10min除掉。提纯好的总RNA经 1％琼脂糖凝胶电泳