RAPD分析─鉴定柑桔体细胞杂种的快速方法RAPDAnalysisARapidMethodtoIdentifyCitrusSoma.pdfVIP

遗传 HEREDITAS(Beijing)17(4):40-421995 ·实验技术与方法 · RAPD分析— 鉴定柑桔体细胞杂种的快速方法 肖顺 元 华（中农业大学园艺系，武汉430070) i-redenckG.Gmitter,Jr.,JudeW.Grosser，黄 舒 美（国佛罗里达大学柑桔研究与教育中心） 摘 要 本文利用改进的DNA提取方法，从Volkamer柠檬(Citrusvolkameriana.Ten.andPasq.）和酸橙 (C.aurantiumL.）及其原生质体杂种植株的叶片中抽提总 DNA，进行 RAPD(RandomAmplified PolymorphicDNA)分析．结果表明：在随机选取的15种引物中，有 10种可单独或与其它引物一道鉴定 这一组合的体细胞杂种．与形态学性状观察、同工酶及DNA杂交分析等方法比较，RAPD分析是一种 可在试管苗期即可直接、准确、快速鉴定柑枯体细胞杂种的方法． 关健词 柑桔，RAPD，休细胞杂种 RAPDAnalysis:ARapidMethodtoIdentifyCitrusSomaticHybrids XiaoShunyuan (HorticultureDepartment,HuazhongAgriculturalUniversity,Wuhan430070) FrederickG.Gmittcr,Jr., JudeW.Grosser, HuangShu (CittusResearchandEducationCenter,UniversityofFlorida,700Exp.Stn.Rd.,LakeAlfred,FL33850,USA) 通过原生质体融合创造种、属间休细胞杂种，在柑桔砧木品种的改良上具有很大的应用潜力 3,〔4)．鉴定体细 胞杂种的常用方法有形态学比较和同工酶分析，这两种方法简便、易行，但在亲缘关系较近的种间融合杂种的鉴定 上有些困难，在再生植株的早期，也不易通过形态学特征进行鉴别．要获得体细胞杂种最直接的遗传证据必须进行 DNA遗传分析．在柑桔上，不少体细胞杂种是通过Southern杂交分析得以鉴定的5,〔S)．但DNA分子杂交分析 需要用较多的组织或器官提取DNA,难以制备适宜的探针，分析过程比较繁琐．在原生质体融合技术日益成熟的 今天，不同柑桔种间属间的休细胞杂种不断增多．因此，需要一种从DNA水平上迅速、有效地鉴定体细胞杂种的 简便方法．自90年代以来，RAPD分析方法已在动物、植物、人类遗传作图和基因分析等诸多领域广泛应用。 本文就其在柑桔本细胞杂种的鉴定上的应用进行了探讨． 1材 料 与 方 法 1.1试验材料 试验所用的Volkamer柠檬(CitrusvolkamerianaTenandPasq.)、酸橙(C.aurantiumL.）两种原生质体融合 亲本植株及其两株体细胞杂种植株均取自美国佛罗里达大学柑桔研究与教育中心Dr.Grosser的温室，，‘． 1.2分析方法 1.2.1DNA抽提 本试验对DNA的提取方法作了较大的改进．取 1-2个嫩梢尖 1（00mg左右或更少），置于灭 4期 肖顺元等：RAPD分析— 鉴定柑桔体细胞杂种的快速方法 41 过菌的1.5m]离心管中，用 自制的玻璃棒将组织捣碎，加人 700u1提取缓冲液 1（00mmol/LTris-HCI,pH8.0, 50mmol/LNa2EDTA,pH8.0,500mmol/LNaCl,IOmmol/L卜琉基乙醇，3%SDS),搅匀后，在65℃水浴中 保温 10分钟，离心 1（2OOOrpm,2分钟），将上清液转人干净离心管中，加人等体积约（600ul)苯酚一氯仿 苯（酚：氯 仿 ＝1:1)溶液，上下摇动混匀几次 离心 1（2OOOrpm,5分钟），将上清液转人干净离心管中，加人 10川5mo1/L醋 酸钠和0.6倍体积的异丙醇，摇匀后，在一20℃下静置 10分钟，离心 1（2OOOrpm,2分钟），倾掉上清液，用75％酒精 洗一次，在室温或真空下干燥DNA,最后加人50u1TE缓冲液 l（