油田土壤中甲烷氧化菌的筛选.pdfVIP

1 油田土壤中甲烷氧化菌的筛选 马强，陶秀祥，侯彤，朱红威，周生芳，张书雅 中国矿业大学化工学院，江苏徐州 (221008) E-mail ：mabanzhang@163.com 摘 要：笔者从胜利油田土壤中筛选出一株甲烷氧化菌，它可以利用甲烷作为唯一碳源进行 生长，革兰氏染色呈阴性。液体培养 5 天后，通过气相色谱对培养体系甲烷浓度进行测定， 发现甲烷气体的消耗率达到 27.70％，进一步证明了该菌可以利用甲烷进行生长。同时进一步 对该菌的生长条件进行了探索研究，发现该菌的生长周期为 120 小时，最优生长条件是温度 30℃、pH 值8.0、接种量5%。由于瓦斯的主要成分为CH4 ，所以此研究为利用微生物治理瓦斯 气体开辟了一条新的途径。 关键词：甲烷氧化菌；瓦斯；筛选；生长特性 1. 引言 从1906年分离出了第一株甲烷氧化菌，至今已经分离鉴定出 100多种，甲烷氧化菌的典 型特征是它含有甲烷单加氧酶，它们可以氧化甲烷生成二氧化碳，并从此过程中获得生长所 需要的能量。据报道甲烷是重要的温室效应气体，其温室效应是二氧化碳的26倍，因此研究 甲烷氧化菌对减少温室效应有积极的意义[1][2]。甲烷氧化菌分布广泛，存在于农田、沼泽、湿 地、森林、草地、垃圾填埋厂、湖泊、海洋等各种土壤或水样等环境中，易于在富含石油或 天然气的地下水或土壤中生长[3][4][5]。有文献报道可以根据地表甲烷氧化菌种群分布进行石油、 天然气的微生物勘探[6][7]。本实验用于筛选甲烷氧化菌的土样采自东营市胜利油田采油现场。 2. 实验部分 2.1 实验材料 (1) 土样：用于筛选菌株的土样采自东营市胜利油田。 (2) 甲烷气：购买于北京氦普北分气体工业有限公司，纯度为99.9 ％。 (3) 培养基成分(g/L)：NaNO 1.0 ，NH Cl 0.25，KH PO 0.26 ，K HPO ·3H O 0.74，MgSO ·7H O 3 4 2 4 2 4 2 4 2 1.0，CaCl ·2H O 0.2，EDTA 0.01 ，微量元素液 10ml，PH ＝7 [8] 。 2 2 微量元素液(g/L)：FeSO ·7H O 0.4, ZnSO ·7H O 0.34, CuSO ·5H O 0.1, MnSO 0.3 ， 4 2 4 2 4 2 4 NaMoO ·2H O 0.24，H BO 0.1 。 4 2 3 3 2.2 实验方法 2.2.1 菌选株的筛选 称取 1.0 g 土样加入 250ml 烧瓶中，然后加入 100ml 蒸馏水，振荡均匀，静置十分钟，然 后用移液枪吸取 10ml 上清液，接种至装有 50ml 培养基的培养瓶中，培养瓶体积为 150ml， 用橡胶塞密封。然后用注射器抽出 50ml 空气，再注入 50ml 甲烷气体，放置在摇床上培养。 摇床条件：120 转/分钟、温度 30℃。在这种培养条件下，除甲烷气体可以提供碳源供微生物 利用以外，接入的土壤上清液中也存在微量的营养物质，所以能够生长的细菌除了甲烷氧化 菌以外还应该存在其它菌株，所以要进行多次转接。十天后取 2ml 上述培养液接入同样培养 基并以同样培养条件再次进行富集培养，如此进行富集培养若干次，得到纯化菌株[9][10][11]。 把液体培养筛选的菌株进行对照实验，以确定其确实是利用甲烷作为唯一碳源进行生长。 1本课题得到煤炭加工与高效洁净利用教育部重点实验室开放课题基金(CPEUKF06-12)的资助。 - 1 - 对照组 1：液体培养