碱裂解叶片两步快速制备PCR模板技术研究.pdfVIP

第 31卷 第 3期 热 带 作 物 学 报 Vo1．31 No_3 201O年 3月 CHINESE JOURNAL OFTROPICAL CROPS Mar．2010 碱裂解叶片两步快速制备PCR模板技术研究 陈平华 ，王恒波 ，许莉萍 ，陈由强 ，陈如凯 1福建农林大学农业部甘蔗遗传改 良重点开放实验室．福州 350002 2福建师范大学生命科学学院．福州 350108 摘要 广泛采用提取 DNA作为 PCR模板的方法主要有 CTAB和 SDS法 2种，但步骤烦琐、耗时长。根据 ro~酶 储存液和 PCR反应缓冲液所含 K+离子 、Cl一离子和 Tween一20等成分 ，以0．05mol／LKOH为强碱裂解物 、2％ Tween一2O为稳定剂配制碱裂解液 ，以0．05mol／L三羟 甲基氨基 甲烷 盐酸 (Tris—HC1)和 2mmol／LEDTA为中和液 ， 经加热裂解和中和两步制备 PCR模板 以甘蔗叶片为材料 ，用新鲜配制含 KOH和 Tween一20的裂解液 ，将适量 叶片放入一定体积的裂解液中加热裂解 ，再中和 ，形成裂解混合物 。直接 以裂解混合物为模板 ，甘蔗 内源基 因 为靶基因．在优化 KOH裂解浓度 、模板体积 、加热裂解 时间以及添加适量聚合酶稳定剂的情况下 ，PCR反应稳 定 ．重复性强 。以有代表性 的单子叶和双子叶植物叶片为材料 ．经过多种内源基 因PCR反应 的反复验证 ，证实 了这种方法的广泛适用性 。该方法通过两步制备 PCR模板 ，无需DNA提取过程 ，使用材料少 ，可以实现活体 PCR检测 ．为遗传分析和分子诊断提供简便 、快速和高效的分析方法 。 关键词 KOH：碱裂解 ；中和 ：PCR模板：酶稳定剂 doi 10．39696．issn．1000—2561．2010．03．016 中图分类号 R394—33 随着分子生物学的快速发展 ．生物技术的研究领域逐渐拓展到生物科学的各个方面。核酸水平的研 究是分子生物学研究的重要内容 ．PCR(polymerasechainreaction)技术作为研究核酸的主要工具，在分子 生物学领域扮演着越来越重要的角色 应用PCR技术研究核酸的前提是制备PCR反应的模板 。也就是将 生物组织内的遗传物质 ，如DNA释放 出来 ．供 PCR分析之用 。常规提取植物基因组 DNA的方法主要有 CTABm和SDSI21法 ．这2种方法各有优缺点，但是都需要对植物组织进行低温研磨 、高温裂解 、残渣分离 、 去除蛋 白、RNA、盐类等杂质 、沉淀DNA并离心分离等步骤，程序复杂 、需要较多植物材料，而且在提取 大批量材料的DNA样品时．由于研磨和提取 DNA过程中许多器皿不得不重复使用 ．往往对于污染高度敏 感的PCR反应产生严重影响。但这 2种方法提取的DNA量较多．对于基因组 DNA酶切分析、Southern杂 交等是必需的。而PCR反应只需要微量的模板 DNA，原理上讲 ，单个细胞的DNA即可进行 PCR反应 。 因此 ．少量细胞组织经过裂解释放出微量 DNA即可满足 PCR反应的需要 。KOH具有裂解细胞的作用 。 并且加热可以提高裂解效率5[-7]。但细胞含有多种复杂物质成分 ，细胞裂解后会形成 DNA、蛋白酶和其它 细胞裂解杂质的混合物 ．水解酶类可能会引起 DNA的降解 如果在 KOH裂解液中添加抑制酶类活性成 分 ．在 PCR反应体系中添加 Taq酶稳定剂和去抑制剂成分 ．则细胞裂解混合物有可能直接作为模板进行 PCR检测 ．而不必利用 CTAB或 SDS方法提取和纯化 DNA KC1和Tris—C1是组成 PCR反应 10xbuffer的 主要成分 ．非离子型去污剂 Tween一20是 Taq酶存储缓冲液的主要成分[81可见这3种成分不会影响Taq酶 的反应活性。BSA是使用较多的Taq酶稳定剂 ；聚乙烯吡咯烷酮 PVP具有抗氧化作用 。在植物 DNA提取 中可以有效减少酚类 、醌类及丹宁类物质对 DNA的损害。并可有效吸附多糖 ，降低对 DNA的影ii1~9[一lol。 基金项 目：国家 863计划项 目(2007AA100701)，福建省科技厅重点项 目(200710036)，福建省外国专家局项 目(20