Western_Blot常见问题解析.pdfVIP

Western Blot常见问题解析 1.电泳中的问题 出现问题 原 因 ︶条带呈笑脸状 凝胶不均匀冷却，中间冷却不好;电泳系统温度偏高 可能是由于装置不合适，特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡，或者两边聚合 ︵条带呈皱眉状 不完全 拖尾 样品溶解不好 纹理（纵向条纹） 样品中含有不溶性颗粒 条带偏斜 电极不平衡或者加样位置偏斜 条带两边扩散 加样量过多 2. Western blot结果中背景高且不均匀 可能的原因 建 议 抗体浓度太高 一抗或二抗浓度太高会导致高背景，降低抗体浓度 使用的封闭液不兼容 对比不同的封闭缓冲液 优化封闭缓冲液，最好的封闭缓冲液具有系统依赖性 提高封闭液中蛋白的浓度 非特异性位点封闭不足 优化封闭时间和/或温度。室温封闭至少1h或者4°C封闭过夜 在封闭液中加入Tween-20，Tween-20的终浓度为0.05% 换一种不同的封闭液 封闭液中与其它蛋白发生 不要用含抗生素蛋白的牛奶封闭，牛奶含生物素 抗体的交叉反应 交叉反应的检测。封闭一张干净的膜，与抗体一起孵育，然后用超感应化学发光 底物检测 洗涤不充分，增加洗涤次 降低HRP结合物的浓度 数和使用缓冲液的体积 如果洗涤液中无Tween-20，添加Tween-20使其终浓度为0.05% 缩短印迹膜曝光到胶片的时间 按照说明书的指示，保证膜始终是湿润的 用一张新膜 膜的曝光时间过久 保证膜完全被液体覆盖，避免其干燥 在孵育过程中始终进行震荡 小心夹膜——损坏膜可能导致非特异性结合 不能空手持膜，始终带干净手套或用镊子 缓冲液污染或结块沉淀 制备新的缓冲液 抗体浓度太高 若一抗和/或二抗浓度过高会产生高背景，降低抗体浓度 μ HRP处产生聚集体 用0.2 m过滤器过滤结合物 结合可产生斑点 用一种新的高质量的结合物 使用新的缓冲液 缓冲液中有污染 缓冲液使用前过滤 保证电泳仪器、印迹仪器和孵育用容器清洁，无外缘污染物 操作设备被污染 保证在转膜后没有凝胶留在膜上，蛋白可能黏在胶上导致背景 3. Western blot结果中信号弱或无信号 可能的原因 建 议 转膜结束后，用总蛋白染色剂染胶来确定转膜效率。（注：总蛋白染色剂可能检 测不到低量的抗原。） 确保转膜过程中胶与膜完全接触。 确保转印夹层排布正确 确保按照膜的制造商的使用说明润湿膜 蛋白未转到膜上 确保转印部件在电印迹过程中未过热 使用正对照和/或分子量Marker 优化转印时间和电流 确保样品制备条件优于蛋白印迹，为破坏样品的抗原性。（注意：许多蛋白不能 在还原状态下进行） 在转膜缓冲液中加入20%的甲醇促进结合。低分子量的