实验七脂肪酸的β氧化.pptVIP

脂肪酸的β－氧化 一、目的了解脂肪酸的β－氧化作用。二、原理 在肝脏中，脂肪酸经β－氧化作用生成乙酰辅酶A 。2分子乙酰辅酶A可缩合生成乙酰乙酸。乙酰乙酸可脱羧生成丙酮，也可还原生成β－羟丁酸。乙酰乙酸、β－羟丁酸和丙酮总称为酮体。 ?氧化的生化历程 酮体的生成—肝脏 本实验用新鲜肝糜与丁酸保温，生成的丙酮在碱性条件下，与碘生成碘仿。剩余的碘，可用标准硫代硫酸钠溶液滴定。 在碱性的条件下，丙酮与碘生成碘仿。反应式如下： 2NaOH+I2→NaIO+NaI+H2O CH3COCH3+3NaOI→CHI3+CH3COONa+2NaOH ??????????????????????????? 碘仿??????????????? 剩余的碘，可用标准硫代硫酸钠滴定。 NaOI+NaI+2HCl→I2+2NaCI+H2O I2+2Na2S2O3→Na2S4O6+2NaI 根据滴定样品与滴定对照所消耗的硫代硫酸钠之差，可以计算由丁酸氧化生成丙酮的量 1.肝糜制备 取新鲜肝脏，用0.9% 氯化钠溶液洗去污血。用滤纸吸去 表面的水分。称取肝组织5 g置研钵中。加少量0.9% 氯化钠 溶液,研磨成细浆。再加0.9% 氯化钠溶液至总体积为10 mL 。 2.取2个50 mL锥形瓶，各加入3 mL 1/15 mol/L pH 7.6的磷酸盐 缓冲液。向一个锥形瓶中加入2 mL正丁酸，另一个锥形瓶 作为对照，不加正丁酸。然后各加入 2 mL肝组织糜。混匀， 置于43℃恒温水浴中保温1小时。 乙酰CoA FAD FADH2 NAD + NADH RCH2CH2CO-SCoA 脂酰CoA 脱氢酶 脂酰CoA β-烯脂酰CoA 水化酶 β-羟脂酰CoA 脱氢酶 β-酮酯酰CoA 硫解酶 RCHOHCH2CO~ScoA RCOCH2CO-SCoA RCH=CH-CO-SCoA + CH3CO~SCoA R-CO~ScoA H2O CoASH TCA 乙酰CoA 乙酰CoA 乙酰CoA ATP H20 呼吸链 H20 呼吸链 乙酰CoA 乙酰CoA 乙酰CoA 乙酰CoA 羟甲基戊二酸单酰CoA（HMGCoA） 脂肪酸 硫解酶 2CH3COSCoA CH3COCH2COSCoA 乙酰乙酰CoA HOOCCH2-C-CH2COSCoA | CH3 OH | HMG-CoA裂解酶 HMG-CoA合成酶 CH3COSCoA CoASH ?--氧化 CH3COCH2COOH CH3CHOHCH2COOH 乙酰乙酸 丙酮 ?--羟丁酸 脱氢酶 CO2 NADH+H+ NAD+ CH3COCH3 脱羧酶 CoASH 三、器材 酸式滴定管 水浴锅 移液管 剪刀及镊子 漏斗等 四、试剂与材料 鲜猪肝 淀粉 氯化钠 丁酸 三氯乙酸 氢氧化钠 盐酸 碘等 3.沉淀蛋白质 保温1时后，取出锥形瓶，各加入3 mL 15%三氯乙酸溶液，在对照瓶内追加2 mL正丁酸，混匀，静置15分钟后过滤。将滤液分别收集在2支试管中。 4.酮体的测定 吸取2种滤液各2 mL分别放在另2个锥形瓶中，再各加 3 mL 0.1 mol/L碘溶液和3 mL 10%氢氧化钠溶液。摇匀后，静置10分钟。加入3 mL 10%盐酸溶液中和。然后用0.01 mol/L标准硫代硫酸钠溶液滴定剩余的碘。滴至黄色时，加入5～6滴淀粉溶液作指示剂。摇匀，并继续滴到蓝色 褪去。记录滴定样品与对照所用的硫代硫酸钠溶液的mL数，并按下式计算样品中丙酮含量。 5.计算 肝脏的丙酮含量（mmol/g）=（A-B）×cNa2S2O3/6 式中： A为滴定对照所消耗的0.01 mol/L硫代硫酸钠溶液的mL数； B为滴定样品所消耗的0.01 mol/L硫代硫酸钠溶液的mL数； cNa2S2O3为标准硫代硫酸钠溶液浓度（mol/L）。