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实验八 细胞器的分离、纯化—细胞分级分离法 一、实验目的 学习细胞分离及纯化的一般原理和方法 实验原理 细胞分级分离法是一种通过离心从而分离细胞内不同结构成分的细胞器（包括核、叶绿体、线绿体、微体等）以研究其形态结构化学组成成份和生理活性的方法。 这个方法包括匀浆法，分级分离，分析三个步骤。通过匀浆化得到细胞匀浆液；把匀浆液放在一定的液体环境下，在离心机中进行离心分离处理。因为离心力的作用，可以把细胞内比重和大小不同的各种结构分开。 细胞器的沉降速度取决于辐射向外的离心场，我们通常用相对离心场表示： RCF=1.11*10-5 其中RCF为相对离心场（单位为g)；n为转数（单位为转数/分）；r为离心半径（单位是cm) 实验用品 一）材料：新鲜菠菜 二）器械：显微镜、高速低温离心机、普通离心机、离心管、200目的尼龙网、漏斗、烧杯、组织研磨器等。 三）试剂： 1. 线粒体离心匀浆介质： 0.25M蔗糖。0.067M PH7.2PBS，0.05MEDTA,0.75mg/ml牛血清白蛋白。 2. 1%Janus greenB的0.25M蔗糖溶液。 3. 0.05M Tris-HCI液体 PH 8.0 0.02MTris 55ml 0.1NHCL 55ml 蒸馏水200ml 4. 0.35mol/LNacl 试验方法 一）玉米黄花幼苗线粒体的分离（整个过程保持在0-4。C） 1.将玉米黄花幼苗剪下，称重每小组约取5g，在冰箱中放置一个小时。 2.将幼苗剪碎直接加入研钵中，以1:3（重量体积比g:m)比例加入离心匀浆PBS介质，快速磨碎，注意先加入少许介质液，研碎后再将余液加入。 3.用双层尼龙网过滤，除去残渣。 4.取滤液在低温高速离心机上2300rpm离心10分钟，弃沉淀。 5.取上清液在低温高速离心机上9950rpm离心10分钟，弃上清。 6.所有沉淀用匀浆介质液洗涤，仍以9950rpm离心10分钟，弃上清。 7.将所得沉淀悬浮于0.5M、PH7.2甘露醇中，置冰箱备用 8.将制备的线粒体悬液滴于干净的载玻片上用1%Janus greenB的0.25M蔗糖液（PH7.4）染色20分钟. 9.加盖玻片（需特别干净）。镜检最好用相差显微镜，凡线绿体均被J染成蓝绿色颗粒，检验制备线粒体的纯度。 二 、菠菜叶叶绿体的分离（整个过程保持在0-4C） 1.取去叶脉的新鲜菠菜5于研钵中，加入0.35mol/LNacl 15ml研磨。注意开始研磨时也是先加入介质，磨碎后再加入剩余的。 2.绿色的匀浆液用尼龙网（200目）过滤，滤液分别转入两只干净的离心管中，以1000rpm离心4分钟，除去沉淀。 3.上清液在高速低温离心机上以3000rpm离心5分钟，所得沉淀即为叶绿体。 4.用0.35mol/L液（视沉淀多少）稀释，置冰箱中保存备用，在干净的载玻片上滴一滴叶绿体悬液，加盖玻片（需特别干净）在显微镜下观察叶绿体的形态。 作业 1.线粒体、叶绿体的形态如何？叶绿体分离是否完整。 2.检验你的分离两种细胞器的纯度如何？ 3.为什么在分离过程中要求研磨快速且保持低温？ * *