高效发酵木糖生产乙醇酵母菌株的构建.pdfVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００９，２９（６）：７４～７８ 高效发酵木糖生产乙醇酵母菌株的构建 李　洁　李　凡　刘晨光　任剑刚　赵心清　葛旭萌　白凤武 （大连理工大学 生物科学与工程系　大连　１１６０２３） 摘要　获得高效发酵木糖生产乙醇的酵母菌株是木质纤维素生物转化生产燃料乙醇的重要前 提。在４％乙醇驯化的基础上，选择了乙醇耐性提高的休哈塔假丝酵母（Ｃａｎｄｉｄａｓｈｅｈａｔａｅ） ＣＩＣＣ１７６６菌株进一步进行紫外诱变，得到了木糖发酵性能较强的呼吸缺陷型突变体，并与乙醇发 酵性能良好的酿酒酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＴＣＣ４１２６进行原生质体融合。采用单亲灭活法 对休哈塔假丝酵母原生质体进行紫外灭活，在聚乙二醇（ＰＥＧ）诱导下融合，对得到的融合子进行 木糖发酵能力测定，选择到了一株能够更好地利用木糖产乙醇，并且木糖发酵性能比亲本得到明 显提高的融合子Ｆ６，此融合子发酵５０ｇ／Ｌ木糖，最高乙醇浓度达到１８．７５ｇ／Ｌ，乙醇得率为０．３７５， 达到理论转化值０．５１１的７３．４％。与原始出发菌株ＣＩＣＣ１７６６相比，乙醇产量提高了２８％。 关键词　休哈塔假丝酵母　酿酒酵母　原生质体融合　乙醇发酵 中图分类号　Ｑ８１５ ［１，２］ 　　燃料乙醇近年来在国内外得到了迅速发展 ，但 原生质体融合技术是获得兼具双亲株优良性状新菌株 目前基于粮食类淀粉质原料的燃料乙醇，已经引发了 的有效手段，相关的研究在国内外均有报道，包括休哈 ［３，４］ 全球范围内的争议 。以各类农林废弃物为代表的 塔假丝酵母与高温酿酒酵母融合，树干毕赤酵母与酿 木质纤维素类生物质是地球上最丰富的资源，以其为 酒酵母融合等，得到的融合子木糖发酵能力均在一定 原料生产燃料乙醇，不仅可以解决当前以粮食类淀粉 程度上优于亲株［９～１２］。 质原料生产燃料乙醇产生的诸多问题，而且可以促进 　　乙醇是酵母生长和代谢的抑制性产物。据报道休 农村经济发展。然而木质纤维素类生物质水解糖中含 哈塔假丝酵母的乙醇耐性很低，野生型休哈塔假丝酵 有不能被乙醇发酵性能优良的酿酒酵母利用的、以木 ［１３］ 母只能耐受３％的乙醇 ，与酿酒酵母相差很大，这可 糖为主要成分的五碳糖，因此能够高效利用木糖生产 能是限制融合株乙醇发酵能力的主要原因。对融合株 乙醇菌株的选育，是木质纤维素类生物质资源生产燃 染色体组成研究表明，融合子往往只保留一个亲本的 料乙醇的关键技术之一。 ［９］ 染色体，同时含有另外一个亲本的部分基因 。木糖 　　酿酒酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）是乙醇发酵的 发酵酵母与酿酒酵母融合株木糖代谢不理想，是否和 优良菌株，但缺乏木糖代谢途径。自然界中存在多种 融合株中含有木糖发酵酵母染色体组成，而只含有酿 木糖发酵菌，如休哈塔假丝酵母 （Ｃａｎｄｉｄａｓｈｅｈａｔａｅ）、 酒酵母的部分基因有关还不清楚，但我们推测提高木 树干毕赤酵母 （Ｐｉｃｈｉａｓｔｉｐｉｔｉｓ）、嗜单宁管囊酵母 糖发酵酵母亲本的木糖代谢能力和乙醇耐性，有可能 （Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎｔａｎｎｏｐｈｉｌｕｓ）等，但多数乙醇产量较低。通 是构建高效木糖发酵菌株的有效方法。 过代谢工程技术将木糖代谢途径整合到酿酒酵母中获 　　本研究基于这个新思路，首先对休哈塔假丝酵母 得具有木糖发酵能力的工程菌株，已有大量研究工作 进行了乙醇驯化和紫外诱变，选择到了乙醇耐