呕吐毒素胶体金快速检测试剂的研发.pdfVIP

呕吐毒素胶体金快速检测试剂的研发 1 1 1 1 2* 杨春柳 ，魏寒冰 ，李 悦 ，傅 巍 ，谯仕彦 （1. 北京龙科方舟生物工程技术有限公司，北京 100193；2. 国家饲料工程技术研究中心，北京 100193） 摘 要：本实验应用胶体金免疫层析技术，研制出一种半定量检测谷物和饲料中呕吐毒素含量的快速检 测试剂。该试剂以胶体金标记高特异性单抗，与偶联抗原进行正交实验，确定最适条件，同时通过不同的 样品前处理方法，满足多种检测限需求（200ppb、1000ppb）。该检测试剂检测方法简便、快速，稳定性好， 与常见霉菌毒素无交叉反应，检测样品结果与ELISA 符合率可达 95.6%。该检测试剂可用于谷物和饲料中 呕吐毒素的快速检测。 关键词：呕吐毒素；胶体金；试纸条 1 引言 呕吐毒素 （vomit toxin ）又称脱氧雪腐镰刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON ），主要是由 镰刀菌的某些种产生的化学结构和生物活性相似的有毒代谢产物，其产毒菌株适宜在阴凉、 潮湿的条件下生长，广泛存在于大麦、小麦、玉米和燕麦中。它具有很高的细胞毒性及免疫 抑制作用，对人和动物均有很强的毒性，能引起人和动物呕吐、腹泻、拒食、皮肤刺激、神 经紊乱、流产、死胎等。猪是对呕吐毒素最敏感的动物，家禽次之，反刍动物由于瘤胃微生 [1] 物的作用，耐受力最强 。国家标准（GB 13078.3—2007 ）规定猪配合饲料中呕吐毒素限量 为1000ppb，家禽和牛配合饲料限量为5000ppb[2] 。 呕吐毒素的主要检测方法有薄层色谱法（TLC ）、高效液相色谱法（HPLC ）、质谱联用、 酶联免疫吸附法（ELISA ）及胶体金免疫层析法。薄层色谱法在处理样品时工作量大，检测 过程中需接触标准品，危害到操作人员的健康。色谱法和质谱法所需检测仪器价格昂贵，需 要专业技术人员操作，且样品前处理复杂，不便推广应用，也不适合大批量样品检测。酶联 免疫吸附法和胶体金免疫层析法操作简便、快速、灵敏度高、可进行定量和半定量检测，且 [3] 无需贵重仪器设备，因此发展迅速 。本研究应用胶体金免疫层析技术对谷物和饲料中的呕 吐毒素进行半定量检测，取得了较理想的结果。 2 材料与方法 2.1 材料 2.1.1 实验材料 呕吐毒素标准品 （DON ，Sigma 公司）；氯金酸（HAuCl ·4H O，国药）；呕吐毒素偶联 4 2 *通讯作者：谯仕彦，Email: qiaoshy@, Tel: 010 作者简介：杨春柳（1984- ），女，硕士研究生，主要从事饲料安全检测。Email: yangcl@ 卵清蛋白（DON-OVA ，北京龙科方舟生物工程技术有限公司）；呕吐毒素单克隆抗体 （DON-Ab ，北京龙科方舟生物工程技术有限公司）；羊抗鼠IgG （上海金标生物科技有限公 司）；硝酸纤维素膜（Millipore ）；胶体金结合垫、样品垫、吸水纸（上海金标生物科技有限 公司）；呕吐毒素定量检测试剂盒（酶联免疫法）（北京龙科方舟生物工程技术有限公司）； FAPAS 饲料标准样品（上海弗帕斯检测技术中心）。 2.1.2 仪器设备 三维平面点膜喷金仪 HM3030 （上海金标生物科技有限公司）；微电脑自动斩切机 ZQ2000 （上海金标生物科技有限公司）；高速冷冻离心机H-2050R （长沙湘仪离心机仪器有 限公司）；紫外连续扫描分光光度计（Thermo ）；数显磁力搅拌电热套（天津市莱玻特瑞仪 器设备有限公司）；电热恒温鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）。 2.2 方法 2.2.1 胶体金的制备 配置1%氯金酸溶液和1%柠檬酸三钠溶液，在圆底烧瓶中加入1L 超纯水加热，煮沸后 加入10mL 1%氯金酸溶液，2min 后加入12mL 1%柠檬酸三钠溶液，继续煮沸，溶液颜色由 黑色逐渐变为酒红色，继续煮沸15min 后停止加热，冷却至室温，4 ℃贮存。紫外扫描检测 胶体金溶液质量。 2.2.2 抗体最佳标记pH 值的确定 取1mL 胶体金溶液，分别加入1、3、5、8、10、15、20μL K CO 溶液调