细胞培养概述2006级研.ppt

超净工作台 紫外灯 滤 器 CO2培养箱 正置显微镜 清洁液的配制 操作时，细胞表面上与其它细胞及支持物黏附与连接的分子被破坏，细胞受到损伤　　接种细胞: 适应，恢复，积累 代谢中间产物 　　组织块: 细胞迁移出一般经数小时-几天 细胞密度：接种的细胞密度越大、数量越多，细胞群体越容易适应体外环境，潜伏期就短。相反，即便是在很小的培养空间内，如接种的细胞数量不够大，潜伏期仍会较长。 细胞类型：传代培养的细胞潜伏期比原代培养的细胞短。传代培养期的细胞,一般为6~24h;原代24~96h或更长。单个细胞快,细胞大团慢,组织块慢。连续细胞系与发生恶性转化的细胞 6-24h 比有限细胞系与正常二倍体细胞的短。来源：胚胎组织:短,2天可见细胞生长；成体组织:长。 细胞机能状态：不良者慢。 培养条件：培养液, pH, 底物等，不利：污染,有毒； 慢。 有丝分裂指数 MI : 指培养物中分裂相数量占全部细胞数量的百分比，统计时，每瓶至少需计数1000个细胞。一般细胞的MI约为0.1 ~ 0.5%；原代培养物的MI比继代培养物低。连续细胞系和肿瘤细胞高，可达3% ~ 5%。 细胞群体倍增时间: 培养物种中细胞数量翻倍的平均时间 MTT法: 反映细胞内线粒体中一种酶活性程度 标记核苷酸 3H-TdR 掺入量：反映DNA合成 支原体污染后的抗生素处理: 第一种方法：使用泰乐菌素（tylosin，Sigma ，泰乐菌素是一种兽用抗生素,常用在鸡、猪的食料辅料，可以防止支原体感染引起的支气管哮喘，至今尚未见有耐药菌株，是治疗支原体感染的特效药。 第二种方法：M-Plasmocin, InvivoGen公司研究开发的新一代支原体抗生素M-Plasmocin能有效地杀灭支原体，不影响细胞本身的代谢，并且用M-Plasmocin处理过的培养细胞，不会重新感染支原体。 第三种方法：用BM-Cyclin-1/2，效果很好，方法如下：细胞传代同时加BM-Cyclin-1 10?g/ml，37℃培养3天，加入BM-Cyclin-2 5 ?g/ml，37℃培养3天；（不需传代，因为支原体污染的细胞生长非常慢！）如果细胞生长恢复正常，即可结束。否则加BM-Cyclin-1 20 ?g/ml，37℃培养3天，加入BM-Cyclin-2 10 ?g/ml，37℃培养3天。怀疑是支原体污染的就可以试试，对细胞不会有太大影响。 3. 病毒的污染和检测 细胞的直接观察 动物接种检查 电子显微镜观察 免疫学检查 PCR技术 常用抗生素用量和效应 抗生素 抗菌谱 细菌 真菌 支原体 常用浓度 青霉素 G+ 100IU/ml 链霉素 G- 100?g/ml 庆大霉素 G+,G- ＋ 200?g/ml 四环素 G+,G- ＋ 10?g/ml 卡那霉素 G+,G- ＋ 50?g/ml 两性霉素 ＋ 2 ?g/ml 制霉菌素 ＋ 25 ?g/ml 四、培养细胞的生物学特征 （一）体外培养细胞的分型 1. 贴附型：大多数培养细胞贴附生长，属于贴壁依赖性细胞，判断细胞形态时不能按照体内组织学标推判定，仅大致分成以下四型： 成纤维细胞 上皮型细胞 游走细胞型 多型细胞型 2. 悬浮型：见于少数特殊的细胞，如某些类型的癌细胞及白血病细胞。胞体圆形，不贴于支持物上，呈悬浮生长。这类细胞容易大量繁殖。 胞体呈梭型或不规则三角形，中央有卵圆形核，胞质突起，生长时呈放射状。除真正的成纤维细胞外，凡由中胚层间充质起源的组织，如心肌、平滑肌、成骨细胞、血管内皮等常呈本型状态。另外，凡培养中细胞的形态与成纤维类似时皆可称之为成纤维细胞。 成纤维细胞型： 1.贴附型 名称：凡在培养中形态与成纤维细胞类似的 来源：由中胚层间充质组织起源的组织如： 　　　真正的成纤维细胞，心肌，平滑肌，成骨细胞， 　　　血管内皮 形态：似体内成纤维细胞的形态，胞体梭形或不规则 　　　三角形，胞质向外伸出2—3个长短不等的突起， 　　　中有卵圆形核 生长特点：排列成放射状，漩涡状，并不紧靠连成片， 细胞—细胞接触易断开而单独行动，游离的单独 　　　的成纤维样细胞，常有几个伸长的细胞突起 细胞呈扁平不规则多角形，中央有圆形核，细胞彼此紧密相连成单层膜。生长时呈膜状移动，处于膜边缘的细胞总与膜相连，很少单独行动。起源于内、外胚层的细胞如皮肤表皮及其衍生物、消化管上皮、肝胰、肺泡上皮等皆成上皮型形态。 上皮型细胞： 名称：仅形态上似体内，实际上不完全相同 来源：来源于外胚层、内胚层细胞, 如： 皮肤及其衍生物,消化道，乳腺，肺泡, 上皮性肿瘤 形态：类似体内的上皮细胞扁平，不规则多角形，中有圆 　　　形核 生长特点：易相连成片，相靠—紧密相连—成薄层—铺石状 　　　生长时