分子生物实验技术.ppt

扩增片段大小 ★ 80-150bp(尽量限制在300bp以内) Primer长度 ★ 17-25base GC含量 ★ 40-60%(最好45-55%) Tm值 ★ ★ ★ 两条引物的Tm值尽量接近，引用专用软件计算Tm值 序列 ★ 整体上碱基不能过偏 个别部分避免GC rich或AT rich(特别是3’端) 避免T/C连续，A/G连续 3’末端序列 ★ 3’末端避免GC rich或AT rich 3’末端碱基最好为G 或C 3’末端碱基尽量避免为T 互补性 ★ ★ ★ 引物内部或两条引物之间避免3base以上的互补序列 引物3’末端避免2base以上的互补序列 特异性 ★ ★ ★ 使用BLAST检索，确认引物特异性 Real Time PCR用引物设计原则 ★号表示重要程度，★号越多，表示该参数越重要，设计时要优先考虑 Real time PCR的标准样品 绝对定量的标准样品： 已知拷贝数的质粒DNA 相对定量中的内标： ---内标通常是β-actin、GAPDH基因等看家基因 ---在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定，受环境因素影响小 ---内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组数量 标准样品DNA拷贝数 用于生成标准曲线的样品浓度如何设定？ ---含有和待测样品相同扩增片段的克隆质粒 ---含有和待测样品相同扩增片段的cDNA