肿瘤的分子分型30分钟.ppt

目前临床检测的主要项目 与化疗相关的基因mRNA的表达量 (ERCC1/BRCA1,TYMS，RRM1,TUBB3,STMN1,TOP2A) 与分子靶向相关的基因的突变 (EGFR,KRAS,BRAF) 基因的拷贝数异常(her2,EGFR) 基因的遗传多态性（UGT1A1,CYP2D6） 遗传性肿瘤的分子诊断 遗传性乳腺癌家族 10%的乳腺癌是家族遗传的，其中主要的原因是 BRCA1（首选I,55%）， BRCA 2（首选II,, 35%） 遗传性非息肉性大肠癌（HNPCC） MSH2(首选1，~60%)， MLH1(首选2, ~30%) ， MSH6(次选,~4%) 家族性结直肠息肉综合症（FAP） 首选 APC，次选 MYH 使用的主要 技术方法： 定量PCR 使用的主要 技术方法： 基因测序 FISH 荧光毛细管电泳 使用的主要 技术方法： 基因测序 突变筛查的关键 1、必须采用同一个体正常细胞对照 2、必须排除数据库中的SNP多态（大多数公司缺少） 3、如何看待突变筛查的灵敏度问题？ 4、微缺失和插入的检出（测序最佳） 5、出现耐药现象后建议对后期的肿瘤组织 重新进行突变检查（取材困难） 6、未知突变的筛查和确认（探针方法失效） 肿瘤基因突变筛查方法优劣比较 液相芯片：准确性差（受杂交等条件影响） 灵敏度一般 未知突变无法筛查 可筛查已知的插入缺失突变 探针类试剂盒方法：准确性高（98%以上） 灵敏度高（探针的优势） 未知突变无法筛查 对插入缺失筛查的能力差 肿瘤基因突变筛查方法优劣比较 测序： 准确性高（几乎100%） 灵敏度一般（测序的灵敏度为10%） 可以筛查任何未知突变 对插入缺失的判断准确 焦磷酸测序：准确性高（几乎100%） 灵敏度一般（灵敏度约为10%） 可以筛查任何未知突变 对插入缺失的判断准确 测序片段只有100-150bp，通量太低 测序突变筛查的难点 石蜡标本的PCR十分困难 为了提高成功率采用多次PCR造成的引入突变，造成假阳性 纯化方法直接决定了测序质量，天昊平台有改进后的纯化方法，比其他测序公司纯化效果好很多 测序数据的分析，需要排除“假突变”，SNP，如何判读插入缺失突变。 突变样本的测序结果 肺癌胸水标本EGFR外显子21错义突变 Leu858Arg 肺癌个体化治疗检测方案 ?卡铂（顺铂） ERCC1或BRCA1 mRNA ?紫杉醇（多西紫杉醇）?长春瑞滨（长春花碱） TUBB3和?STMN mRNA ?培美曲赛 TYMS mRNA ?吉西他滨 RRM1 mRNA ?依托泊苷 TOP2A mRNA ?西妥昔单抗 KRAS 突变筛查 ?厄洛替尼 吉非替尼EGFR?KRAS B-raf 突变筛查 举例说明 天津肿瘤医院——开始自己做测序，结果反复出现假突变，最后与我们合作。 福建肿瘤医院——大肠癌石蜡标本KRAS 基因PCR成功率低于50%，且不会排查SNP，后选择与我们合作。 定量PCR检测的技术要点 必须使用肿瘤组织作为检测对象，组织必须保存在特定的保存液中，石蜡片子中mRNA降解严重，量又少，定量PCR成功率较低。 对同一个样本必须使用GAPDH或者B-actin作为对照基因，校正取样细胞数的差异 必须进行2重复的定量实验，防止操作失误和随机误差 基因表达的高或低是一个相对值，需临床数据和资料才能确定何种表达水平适合用何种治疗方案。 定量PCR检测结果 石蜡标本mRNA检测作为临床参考的科学性商榷 石蜡标本检测出的mRNA水平高低，作为临床化疗的参考，必须十分谨慎，理由如下，请仔细考虑以下两个问题： ? ?1年前的石蜡标本所检测的mRNA水平是否会因为降解而低于真实值？ 1年前病人的组织mRNA水平与现在病人的组织mRNA水平是否会发生剧烈的变化而使检测结果失去参考价值？ （就像突变也会随着时间的推移发生新的耐药突变一样） ? 肿瘤治疗的分子分型和异病同治 传统的肿瘤的形态学和组织