运用固定寡核苷酸探针杂交检测人类mtDNA+HVI区碱基变异会议论文.pdfVIP

生垦鲨医堂量堑型翌量塞壁 运用固定寡核苷酸探针杂交检测 人类mtDNA HVI区碱基变异 曹 洋1，贾东涛1，万立华2，黄映雪1，胡淑辉3 (1．江苏省公安厅刑侦局，江苏南京210024；2．重庆市刑事科学技术研究所，重庆400042； 3．西南政法大学，重庆400031) 【摘要】 目的运用固定寡核苷酸探针杂交检测人类mtDNA HVI区碱基变异。方法设计了21组序列特异性 探针固定于膜上，杂交检测mtDNAHVI区的碱基变异，对重庆地区汉族人群83名进行分型。结果检测到55种基因 型，有16种基因型含两个以上的样本，其中最多的是1111212，含7个样本。运用该方法检测结果基因多样性为 98．“％，两个无关个体的偶合率为2．74％。结论结果显示运用固定SSO探针杂交的方法需要的设备简单，结果分析 一目了然，适宜于在中小实验室推广，可进行一些初步筛选排除工作，对需要进一步分析的样本再进行测序。 【关键词】 法医物证学；mtDNA；SSO 目前检测mtDNA碱基变异的主要方法是PCR后 表1 HVI探针序列 直接测序、限制性内切酶酶切和序列特异性探针杂交 Oligonucleotide，SSO)¨““o法医 (SequenceSpecific 科学家主要运用PCR后直接测序的方法分析mtDNA 的碱基变异。Stoneking等运用寡核苷酸探针杂交的 方法代替直接测序对大量样本进行检测【12’l3|。他设 计了包含mtDNA控制区9个不同区域的23组SSO探 针，进行斑点杂交检测其碱基变异。为了能快速、简 单地进行mtDNA分型，我们运用固定SSO探针的方 法进行分析。 1材料与方法 1．1材料 样本重庆地区无关个体血样83份。 主要仪器杂交箱、杂交管、带正电荷尼龙膜、 狭线多样抽滤加样器(美国BIO—Rad公司)。 DIGDNA andDetection 主要试剂 Labeling Kit、 DIG Easy Hyb(美国Roche公司)。 1．2方法 探针设计及合成探针(上海生物工程公司合 成)设计原则是用数目最少的探针检测出最大的基 因多样性。同时考虑其配对的稳定性大小：AT， GCGTGA，GGAA，’CATI，CT，CC…。设 计21组探针固定于尼龙膜上，探针序列见表1。选 择该组探针检测16058的碱基变异。s为阳性对照探 DNA印迹的制备裁一张大小合适的尼龙膜， 针，与所有个体均能产生较强的信号。 将其置于20×SSC液面，让其自然浸没，放置 洼匿蛰适堂 20×SSC，使其终浓度为6×SSC用5001山1蒸馏水预洗 膜，将样品加于膜上。将膜置于80℃孵箱中2h，然 后室温下保存。 DNA提取(略) mtDNA HVI区特异片段的扩增及检测(略) PCR产物的标记取15IxlPCR产物，煮沸变性 10min，然后迅速置于冰水中。采用20山体系标记 (模板DNA Mix10x2“l，DNTP 20VI，Hexanucleotide Mix2 labelingV1，Klenowenzymelabelinggrade1斗1)。 0，2mol／L 混匀后37℃过夜。加2斗l EDTA(pH8．0) 停止反应，或加热至65℃10min。 图1 固定SSO探针杂交分型结果显示 基因型为：1123111 杂交预热杂交液10ml至杂交温度38。C，将膜 及杂交液放入杂交