人类神经tau蛋白溶液构象与肝素的影响.pdfVIP

人类神经tau蛋白溶液构象及肝素的影响‘ 赫荣乔罗健颖 (中国科学院生物物理研究所视觉信息加工并放实验室) 摘要作者通过对人类神经tau蛋白在E00b．中的表达及分离纯化，并观察肝索对其分子聚集和脱磷酸化的影 右有明显改变。tau蛋白分子的聚集在低温状态下较为明显，说明人类神经tau蛋白在常温下可能具有某种相对稳 tau的异常磷酸化而导致分子聚集，但是我们观察到肝素同时具有促进tau蛋白的脱磷酸化作用。提示肝索可能具 有调节tad蛋白分子磷酸化和聚集状态的作用。 关键词tau蛋白肝素磷酸化 1前言 association tau蛋白是mierotubule 长发育密切相关…。该蛋白有促进细胞内微管蛋白的聚集及稳定微管的功能，并与轴突的通讯传导以及神 淀。因此，有人认为肽骨架结构处于随机变曲的状态。病理学研究发现，tau蛋白在体内聚集形成的配对螺 helical 旋样纤维(p如ed f‰enls，PhT)是早老性痴呆(AD)在病理学上的基本病变之一15 功能不仅具有分子生物学方面的意义，同时对早老性痴呆发病机理的探索以及防治都具有重要的价值。最 然而，到目前为止对tau蛋白在溶液中的结构依然不清楚。我们采用磷酸化、脱磷酸化、荧光、盐酸胍变性等 手段研究了lau在溶液中的结构以及部分影响因素。 2材料与方法 2．1实验材料 见参考文献[9]。 2．2内源荧光的测定 2 *本课题为中国科学院院长基金、中国科学院仅器装备基金以及国家自然科学基金回国启动费(39610710141)资助项目。 305nm的内源荧光(Xex=230nm或kex=275lira；slits：Ex=5．0nm；Em=5．0nm)。 2．3 tau蛋白的磷酸化 50 NCLK的分离纯化见参考文献[10]。取o．5mgtau蛋白，溶于500∥Ln1Tmol／LHepse DTF；1．0mmol／L．L MgCl2；1．0mmol／L nits NCLK．30tC保温过夜。用SDS检验磷酸化的效果。 2．4 tau蛋白盐酸胍变性 0．03mg／mLtau蛋白溶于25mrnolZL磷酸缓冲液(pH 源荧光的变化。 2．5 tau蛋白的脱磷酸化 40止磷酸化tau蛋白加入25mmol／L buffer(含0．1mmol／LEDTA；0．1Inmol／LNaCl；0．2mmolfL Hepes PP2B，30。C进 行反应，分别在不同时间取样用于SDS．PAGE。Heparin按所需要的浓度加入反应体系。 3结果与讨论 3．!，^’类神经taH蛋白的内源荧光 Bin和275Bill有最 们测定了tan蛋白Tyr残基的内源荧光。其最大发射波长在305nnl，激发波长分别在230 源荧光强度一旦变化也就代表了这些残基所处的微环境的变化。 3．2 tau蛋白的盐酸胍变性 的作用。另外，这些结果还揭示，虽然tau蛋白不具有明显的二级结构，但在常温下它可能具有某种稳定分 子构象，并能被GuHCl微扰发生改变。 3．3温度对lau蛋白结构的影响 蛋白质空间结构的稳定性与温度密切相关，为了验证神经tau在溶液中的构象是否是随机的，我们观察 溶液结构。同时也进一步说明了tan蛋白在常温下，具有一定的溶液空间结构。 3．4肝素促进tau蛋白分子的聚集 对肝素的作用还没有进行过比较。我们测定了tau蛋白在37℃的磷酸缓冲液中散射光强度的变化动力学过 (9．14X10“)。以上结果表明，肝索在动力学上可能促进tau蛋白分子的聚集。 3．5肝素对磷酸化tau蛋白构象的影响 结果暗示，肝素可能有改变tau蛋白分子局部构象的作用。 3．6 tⅫ蛋白的脱磷酸化 64 人类神经tau蛋白溶液构象