α淀粉酶菌株摇瓶发酵初筛及酶活力测定.ppt

α-淀粉酶菌株摇瓶发酵初筛及酶活力测定 目的要求 了解利用微生物摇瓶发酵初筛的目的。 了解发酵用培养基的配制要求。 掌握碘比色法（部颁标准）测定α-淀粉酶活力的原理和方法步骤。 发酵培养基（100mL装于500mL三角瓶） 可溶性淀粉 8g； 豆粕粉 4g； Na2HPO4 .12H2O 0.8g； （NH4）2SO4 0.4g； CaCl2 0.2g NH4Cl 0.15g； CaCO3 0.15g 水100mL 121.3℃灭菌20分钟 发酵培养基配制说明 三角瓶规格要统一。 先将不溶解的可溶性淀粉、豆粕粉、 CaCO3分别称于500mL三角瓶。 将无机盐称量后先溶解于水中，调节pH为7.0~7.5，再用量筒量取100mL加于三角瓶中，轻摇混匀。 121.3℃灭菌20分钟 灭完菌后取出，要马上轻摇混匀（？）。 种子培养基（下周使用） 可溶性淀粉 3g； Na2HPO4 .12H2O 0.4g； （NH4）2SO4 0.2g； CaCl2 0.2g NH4Cl 0.15g； 4%豆粕粉浸出液 100mL 煮沸使淀粉溶解后，取50mL分装于250mL三角瓶（2瓶）包扎；取5mL分装于18×180mm试管中（5支），加塞包扎。 121.3℃灭菌20分钟 其它器材 1mL无菌吸管 10支 2mL无菌吸管 5支 相关碘液的配制 碘原液：称取碘11g，碘化钾22g，置于小烧杯中，加10ml蒸馏水使之溶解，然后转入容量瓶中。再加少量的蒸馏水洗涤烧杯数次，洗涤液均转入容量瓶中，最后定容至500ml。摇均后放于棕色瓶中备用。 比色稀碘液：取碘原液2ml，加碘化钾20g，再用蒸馏水定容至500ml。摇均后放于棕色瓶中备用 标准比色碘液：取碘原液15毫升，加碘化钾8克，用蒸馏水定容至500毫升。储藏于棕色瓶内。 pH6.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液： pH6.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液：称取磷酸二氢钠（Na2HPO4.12H2O）45.3g，柠檬酸（C6H8O7.H2O）7.74g，先在烧杯中使之溶解，然后转入容量瓶中定容至1000ml。 2%可溶淀粉溶液及标准糊精溶液配制 2%可溶淀粉溶液：称取20g可溶淀粉，放入小烧杯中，加少量蒸馏水做成悬浮液。然后在搅拌下注入沸腾的700mL蒸馏水中，继续煮沸一分钟（透明），冷却后用pH6磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液定容至1000ml。 标准糊精溶液：取0.06克化学纯糊精悬于少量水中调匀，然后倾入90毫升正在煮沸腾的蒸馏水中，冷却后定容至100毫升，滴加数滴甲苯（现配现用就不用加），冰箱保存。 标准终点色溶液 1、第一种标准终点色溶液 取1mL标准糊精液和3mL标准稀碘液混合。 2、第二种标准终点色溶液 A液：精确称取氯化钴（CoCl.6H2O）40.2493g和重铬酸钾（K2CrO7）0.4878g，用蒸馏水定容至500ml。 B液：精确称取络黑T40mg，用蒸馏水定容至100ml。 同时取A液40ml、B液5ml、混合后置于冰箱中待用。混合液在15天内使用有效。 方法及步骤 发酵培养基灭菌冷却后，利用接种环接种一环上周培养好的斜面菌种。 37 ℃摇瓶培养（往复式110转/分钟）2天。 2天后小漏斗脱脂棉花过滤发酵液。 测定发酵液中α-淀粉酶酶活力单位（碘比色法）。 根据结果选出1~2株进行下周的复筛试验。 所选菌株产α-淀粉酶摇瓶发酵复筛试验的安排 上课前一天下午17：00~17：30将斜面菌种接种一环于5mL种子培养基中（装于18×180mL），37 ℃摇瓶培养（旋转式150转/分钟）14~16hr。 上课当天上午8：00~8：30将上述摇瓶培养好的菌种，用1mL无菌吸管吸取1mL接种于50mL种子培养基中（装于250mL三角瓶）， 37 ℃摇瓶培养（旋转式150转/分钟）8~10hr。 所选菌株产α-淀粉酶摇瓶发酵复筛试验的安排 当天上课时间制备发酵培养基，3~5瓶/株菌（100mL/瓶），灭菌。 将摇瓶培养好的菌种，用2mL无菌吸管吸取2mL接种于100mL发酵培养基中（装于500mL三角瓶）， 37 ℃摇瓶培养（旋往复式110转/分钟）2天。 2天后小漏斗脱脂棉花过滤发酵液。 测定发酵液中α-淀粉酶酶活力单位（碘比色法）。 根据结果可以判断所选菌株产酶能力是否稳定。 实验 α-淀粉酶活力测定方法介绍 酶活力测定的方法 碘比色法（有相应的国家标准） 在一定反应条件下，1小时转化1g淀粉变为糊精的酶量定义为1个酶活力单位 3，5-二硝基水杨酸比色法（DNS法） 在一定反应条件下，1分钟反应生成1mg麦芽糖的酶量定义为1个酶活力单位 注意：去除β-淀粉酶的干扰 医学上的一些测定方法（专用试剂盒，