生物技术实验报告.docxVIP

组别：第六组 组员：苏琳伟、陈治、陈家和、陈硅 报告人：陈硅 学号词汇释义： Parafilm 封口膜 Chloroform 氯仿（三氯甲烷） Isopropanol 异丙醇 DEPC 焦碳酸二乙酯 TRIZOL a mono-phasic solution of phenol and guanidine isothiocyanate Phenol 苯酚 isthiocyanate 异硫氰酸胍 MCS multiple cloning site （polycloning site） 注：MSC是DNA载体序列上人工合成的一段序列，含有多个限制内切酶识别位点。能为外源DNA提供多种可插入的位置或插入方案。 实验任务： 从猪肌肉纤维中提取RNA; 2对RNA上EGFP基因密码子片段进行RT-PCR扩增; 将经RT-PCR技术扩增的cDNA与插入载体质粒，并将其转化入大肠杆菌进行克隆； 从大肠杆菌中提取含目的基因的载体质粒。 实验目的: 1.掌握提取纯化总RNA的原理和技术； 2.掌握RT-PCR原理和技术； 3.掌握TA克隆原理和技术。 实验原理： 总RNA提取和纯化 RNA 分离的最关键因素是尽量减少RNA 酶的污染。但RNA 酶活性非常稳定，分布广泛，除细胞内源性RNA 酶外，环境中也存在大量RNA 酶。因此在提取RNA 时，应尽量创造一个无RNA 酶的环境，包括去除外源性RNA 酶污染和抑制内源性RNA 酶活性，主要是采用焦碳酸二乙酯（DEPC）去除外源性RNA 酶，通过RNA 酶的阻抑蛋白Rnasin 和强力的蛋白质变性剂如异硫氰酸胍抑制内源性RNA 酶。 Trizol试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂，是一种由苯酚和异硫氰酸胍组成的单相溶液它在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性，裂解细胞并释放出RNA,酸性条件使RNA与DNA分离,加入氯仿后离心，样品分成水样层和有机层。RNA存在于水样层中。收集上面的的水样层后，RNA可以通过异丙醇沉淀来还原。在除去水样层后，样品中的DNA和蛋白也能相继以沉淀的方式还原。乙醇沉淀能析出中间层的DNA，在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白。共纯化DNA对于样品间标准化RNA的产量十分有用。 无论是人、动物、植物还是细菌组织，各种样品最大使用量（1ml Trizol），动物组织( 50mg)，植物组织(100 mg)，丝状真菌( 100mg)，动物细胞(5×106～1×107)，酵母(1×107) 。 TRIZOL试剂能促进不同种属不同分子量大小的多种RNA的??出。例如，从大鼠肝脏抽提的RNA琼脂糖凝胶电泳并用溴化乙啶染色，可见许多介于7 kb和15 kb之间不连续的高分子量条带，（mRNA和hnRNA成分）两条优势核糖体RNA条带位于~5 kb (28S)和~2 kb (18S)，低分子量RNA介于0.1 和 0.3 kb之间 (tRNA, 5S)。当抽提的RNA用TE稀释时其A260/A280比值≥1.8 。 Rnase 污染的10大来源 1：手指头 2：枪头 3：水/缓冲液4：实验台面 5：内源 Rnase 6：RNA 样品7：质粒抽提 8：RNA 保存 9：阳离子 (Ca, Mg) 10：后续实验所用的酶 RNA提取须杜绝外源酶的污染，实验时应注意 一．严格戴好口罩，手套。 二．实验所涉及的离心管，Tip 头，移液器杆，电泳槽，实验台面等要彻底处理。 三．实验所涉及的试剂/溶液，尤其是水，必须确保 RNase-Free。 RNA纯化流程图 （附：上清不含DNA的原因： 1.因为细胞中存在DNA酶，在提取之前细胞破碎的时候没有加DNA酶抑制剂，DNA已经被分解了。 2.上层水相，PH 5.1左右，当溶液pH在酸性的时候，DNA分子就会沉淀在酚与溶液的界面，只有RNA分子留在水相。而当pH接近中性时，DNA就会溶解在水相，（导致PH中性的大概原因是trizol与样品比例不对，应该尽量保证提取量的前提下使trizol过量） RNA纯化要求 1 纯化后不应存在对酶(如逆转录酶)有抑制作用物质 2 排除有机溶剂和金属离子的污染 3 蛋白质、多糖和脂类分子等的污染降低到最低程度 4 排除DNA分子的污染 B．RT-PCR 一、知识背景： 1、基因表达：DNA RNA Protein 单拷贝基因表达存在逐步放大机制，如一个蚕丝心蛋白基因104 个丝心蛋白mRNA（每个mRNA 存 活4d，可以合成105 个丝心蛋白） 共合成109 个丝心蛋白