实验一口腔粘膜细胞基因组DNA制备.pptVIP

聚丙烯酰胺凝胶中DNA的银染 原理 在弱酸环境下银离子可以与DNA结合，碱性甲醛溶液可以将结合的银离子还原成金属银，显影成DNA区带。 实验材料及试剂 材料：DNA非变性PAGE胶 试剂及其功能： 10%乙醇 1%硝酸 0.2%硝酸银 显色液（3% Na2CO3，1%甲醛，新鲜配制） 3%乙酸 电泳完毕后，撬开玻璃板，将粘有凝胶的玻璃板置于塑料盘（不要碰凝胶表面！） 用蒸馏水漂洗两次，并取出玻璃板 去水后，用10%乙醇进行凝胶固定 10 min，轻摇 去乙醇，水洗、加入1%硝酸，轻摇5min 吸出硝酸，用蒸馏水漂洗2次 实验操作及注意事项 （下列加液量以刚好覆盖凝胶为宜） 加入0.2%硝酸银溶液，轻摇20min 蒸馏水漂洗3次 去水后，加入显色液，在非直射光线下观察显色 观察区带出现，效果最佳时移除显色液 加入3%乙酸，轻摇5min 移除3%的乙酸溶液，10%乙醇洗涤1次 观察结果? 蛋白质聚丙烯胺凝胶电泳 1.电泳和电泳分离蛋白质的原理概述 电泳概念及电泳分离物质的原理 带电粒子电荷特性（性质与电量） 带电粒子分子特性（结构与大小） ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 电泳分离蛋白质的原理 蛋白质两性解离与等电点 溶液pH与蛋白质PI决定蛋白质电荷性质与数量 不同蛋白质分子大小和分子形状的差异 pHPI 蛋白质带负电荷 向（+）方向移动 pH=PI 蛋白质总电荷为零 在电场中不移动 pHPI 蛋白质带正电荷 向（-）方向移动 2. 蛋白质的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS） 聚丙烯酰胺凝胶与电泳 聚丙烯酰胺胶作为电凝泳材料的特性 人工合成聚丙烯酰胺凝胶的化学体系 化学体系的组成及功能： Acr：丙烯酰胺 Bis：甲叉双丙烯酰胺 AP：过硫酸铵 TEMED：四甲基乙二胺 聚丙烯酰胺凝胶浓度与交联度 凝胶总浓度T=[(a+b)/m]×100% 交联剂百分比C=[b/(a+b)] ]×100% a为Acr克数，b为Bis克数， m为缓冲液体积（ml) a:b＜10 凝胶变脆、硬、呈乳白色 a:b＞100易断裂 （一般a:b=30左右，根据T可适当调整） Gel 5% 10% 15% 29 45 66 97 200 29 45 66 97 200 29 45 66 97 200 不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质的原理 不连续PAGE的三个不连续 不连续PAGE的三个效应 凝胶孔径不同 缓冲液pH不同 缓冲液离子成分不同 浓缩效应 电荷效应 分子筛效应 Gly - Pro - Cl- Gly - Pro - Cl- Cl- Cl- Cl- Pro - Pro - Pro - Gly - Gly - Gly - pH为8.9的电泳缓冲液（Tris-Gly） pH为6.7的浓缩胶 pH为8.3的分离胶 有效泳动率： MCl- M Pro- M Gly- 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS） SDS中的变性剂： 二硫键还原剂二硫苏糖醇（DTT）或 ?-巯基乙醇 SDS：十二烷基硫酸钠 SDS是一种阴离子去垢剂，SO32-带负电荷。在含有强还原剂的SDS溶液中可形成SDS-蛋白质复合物。由于结合大量带负电荷的SDS，好比蛋白质穿上带负电的“外衣”，蛋白质本身带有的电荷则被掩盖了。从而起到消除各蛋白质分子之间自身的电荷差异的作用 3. 试剂的准备 30%丙烯酰胺混合液（Acr:Bis 为29:1） 10%SDS（十二烷基硫酸钠） 1.5mol/L pH8.8 Tris-HCl缓冲液 1.0mol/LpH6.8Tris-HCl缓冲液 Tri