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肝癌细胞凋亡研究 王文亮 第四军医大学病理学教研室西安710032 肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一，虽然国内外对其进行了长期而广泛的研究，但其病因 及发病机理尚不完全清楚。以往人们对肿瘤的发生发展多从肿瘤细胞增殖角度来研究，丽很 少从其反面一细胞死亡来研究。事实上，肿瘤的发生发展在很大程度上取决于细胞的增殖与 细胞死亡这一对矛盾的转化。当细胞增殖大于细胞凋亡时，就有肿瘤发生的可能；当细胞凋 亡大予细胞增殖时，就有肿瘤缩小的可能。人原发性肝癌的发生发展也是如此。细胞凋亡 cell death)是细胞死亡的一种特殊形式，是生物界 (apoptosis)或细胞程序性死tS(programmed 重要的生命现象之一，是一重要的负性调节因素，在生理及病理情况下常见的一种现象。细 胞凋亡与肿瘤的发生发展具有密切关系。细胞揭亡与肿瘤的发生发展是近年来国内外新的研 究热点，特别是对肿瘤细胞凋亡的基因调控及相关基因及其蛋白的研究更为重要。这些研究 有助于探讨肿瘤发生的机制，对肿瘤诊疗和肿瘤治疗新的探索也至关重要，具有重要的理论 意义及实用价值。 我们在以往肝炎病毒与肝癌发生关系研究的基础上，近年来研究了细胞凋亡与肝癌的关 系，进一步探讨了肝癌发生的机制，为防洽肝癌提供了新的理论根据。本项研究从肝癌细胞 培养建立肝癌细胞凋亡模型开始，采用分子生物学技术转染野生型p53，p21wA”““，Bcl-2 核酶及PTEN等基因对肝癌细胞凋亡的影响；构建了肝癌凋亡细胞基因cDNA文库，筛选 了肝癌细胞凋亡的相关基因。并测其核酸序列；同时对肝癌凋亡细胞相关抗原、相关蛋白也 进行了研究；还研究了HBV和HCV抗原对肝癌细胞凋亡的影响等。这些研究结果有助于 进一步阐述肝癌的发生机理，也为肝癌的基因治疗探索一条新的途径。 现将我们近年来对细胞凋亡和肝癌关系的研究工作报告如下： 一、肝癌细胞凋亡模型建立及凋亡细胞检测 1．阿霉素诱导肝癌细胞凋亡模型建立 应用抗癌药物阿霉索诱导培养的人肝癌细胞株HCC．9204肝癌细胞发生凋亡。利用四唑 盐比色试验(MTr法)、光镜、电镜、流式细胞仪、DNA电泳、DNA末端标记技术等证明 为凋亡细胞。该模型的主要参数是以o．5帅lll放线菌素D抑制20斗gmol／L阿霉素作用肝癌细 仪测定，出现典型的凋亡峰，凋亡细胞占72％，用20umol／L阿霉索诱导肝癌细胞凋亡后， 细胞周期Gl期、s期和G2期分别为76％、24％和0％，肝癌细胞活细胞率为35．5％。透射 电镜下，大部分肝癌细胞体积明显缩小：细胞表面的微绒毛明显减少甚至消失；有的肝癌细 胞膜上出现一魑小泡：胞质内细胞器可辨认，可见许多由膜结构包裹的凋亡小体(apoptotic bodies)，内含有退变的细胞器。核膜完整、染色质浓集成块，在核膜下边集，呈新月体状或 围绕核膜周围分布。在扫描电镜下，肝癌凋亡细胞表面光滑，微绒毛消失，胞膜可见许多小 泡形成，有的小泡脱离胞体。从上述实验结果表明．用抗癌药物诱导肝癌细胞发生的形态改 4 变及DNA结构断裂等表现符合细胞凋亡的特征。这为进一步研究肝癌细胞凋亡相关基因及 其基因调控奠定了基础，为进一步探讨肝癌细胞凋亡的分子机理提供了条件。 2．乙醇诱导肝癌细胞凋亡模型建立 用含6％乙醇的培养液培养6小时诱导肝癌细胞系HCC一9204肝癌细胞凋亡，用台盼蓝 33 染色，Hoedrst258荧光染色。末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL) 法检测和流式细胞仪DNA含量分析。SDS，PAGE电泳分析诱导细胞凋亡前后的细胞蛋白表 33258 达情况。肝癌细胞凋亡检测：形态学观察，大部分肝癌细胞为台盼蓝拒染；Hoechst 染色显示．大部分肝癌细胞的胞核呈固缩变园，深染，染色质呈环状、碎块状或新月体状等； TUNEL法检测，大部分肝癌细胞核呈圆形、椭圆形、新月体形或环形黄绿色荧光；流式细 胞仪分析，6％乙醇诱导凋亡的HCC．9204细胞出现亚二倍体凋亡峰：SDS电泳分析， 乙醇诱导的肝癌凋亡细胞出现新的大分子蛋白，为97．4KD。上述研究结果表明，用6％的乙 醇可成功