hIL-24的胞外分泌表达与生物学活性研究.pdfVIP

hlL一24的胞外分泌表达及生物学活性研究 宁亚蕾 周立雄 毛旭虎 肖 洁 张卫军 杨 琚 肖、斌 邹全明 重庆第三军医大学临床微生物教研室，重庆，400038 摘要 目的实现hIL一24的胞外分泌表达，并验证其体外诱导肿瘤细胞凋亡的生物学活 性。方法克隆hIL一24并将其分泌表达至胞外培养基中，用ELISA试剂盒定量检测培养上清 中重组hll。一24的表达量，用MTT法和形态学实验观察培养上清中hlL-24诱导乳腺癌细胞 MCF一7凋亡的活性。结果重组hIL一24被分泌至胞外培养基中，分泌量为336．599／L；其对正 常细胞生长影响较小，而显著抑制了MCF一7的生长，并诱导了MCF一7细胞的凋亡。结论利 用pQABPS／M15系统能够成功分泌表达hIL一24并有利于其生物学活性。 关键词hlL一24；胞外分泌；肿瘤；凋亡；分泌系统 达，Western 白细胞介素24(IL一24)又称黑色素瘤分化相关 抗原7(MDA一7)[川，可选择性抑制广谱肿瘤细胞生的表达。 长，促进肿瘤凋亡，而对正常细胞没有影响，并具有 一定的免疫调节能力，是肿瘤免疫基因治疗的候选 量 基因C2．3|，但其临床应用仍有很多障碍，受到限制。 用样品稀释液将标准品稀释成0，7．81，15．62， 因此，采用基因工程手段大规模生产高纯度具有生 物活性的重组人IL一24。可为深入研究其诱导肿瘤加入5“J标准晶或5舡l已稀释(稀释100倍)待测样 细胞凋亡的机制和肿瘤治疗奠定基础。 品于反应板孔中，轻轻混匀10秒。每孔加入200“l 在制备基因工程重组蛋白时，胞外分泌表达方 antiIL一24 式在维持目的蛋白的活性、稳定性，减轻宿主代谢负 HRP，轻轻混匀10 钟，洗板5次。每孔加入200,“l 担及简化下游纯化步骤等方面具有优势[4一]。我们 秒，37℃温育30分钟，洗板5次。每孔加入100tfl 在前期实验中，成功构建了原核通用胞外分泌表达 TMB显色液，轻轻混匀10秒钟，置暗处室温温育 20分钟。每孔加入100“l终止液，轻轻混匀30秒， 质粒系统pQABPS／M15c引，本研究拟利用该系统将 hIL一24分泌至胞外培养基中，并进行体外诱导肿瘤 细胞凋亡的实验。 标，以标准品浓度为横坐标，绘制标准曲线。根据样 品的0D值可在标准曲线上查出其浓度。 材料与方法 4．IL-24的生物学活性研究 1．材料 4．1MTT比色法测定肿瘤细胞增殖情况 质粒pQABPS由前期实验构建[6】，pAl28a质 粒、E．coliM15菌株、乳腺癌细胞MCF一7、正常人成 培养细胞，用完全培养基配成细胞悬浮液，取20％1 纤维细胞NHI，F由本室保存，hIL一24El。ISA检测 试剂盒购自上海朗卡生物技术公司。 2．hlL-24基因的克隆和表达 养上清为阴性对照。每孔加入25“lMTT溶液， 37℃下继续培养4h。用甩板机去尽孔内的培养上 以pAl28a质粒为模板，Pil(5-CCGAGC- TCGCCCAGGGCCAAGAATTC．3’，含SacI酶切 清。每孔再加入100,ul 位点)，Pi2(5’一AAAAGCGGCCGCGGAGCTTG—置过夜，用微孔酶标仪在570nm处测定其光吸收值 TAGAAT一3’，含Notl酶切位点)为引物，扩增 (A值)。每个处理作6个复孔。肿