甘草素联合阿霉素诱导人肝癌HepG2细胞凋亡与其机制的研究.pdfVIP

甘草素联合阿霉素诱导人肝癌HepG2细胞凋亡及其机制的研究 吴雨晨 王旸 石惠 严淑 蔡云清 南京医科大学公共卫生学院营养与食品卫生学系 [摘要]目的 研究甘草素(LQ)联合阿霉素(ADM)对人肝癌HepG2细胞生长抑制及诱导细胞凋亡的 影响。方法 采用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法观察不同剂量的甘草素(200，300，400μM)和阿霉素(1，2 μM)联合应用对HepG2细胞增殖的影响；采用Hoechst33258染色法观察甘草素联合阿霉素作用 HepG2细胞48h后诱导细胞凋亡的形态学改变;采用AnnexinV-PI双染法经流式细胞仪(FCM)检测 甘草素联合阿霉素诱导HepG2细胞的细胞凋亡率；通过Westernblot方法检测凋亡相关蛋白cytosolic cyt-c、caspase-9、caspase-3的变化。结果 甘草素与阿霉素联合用药比单独应用阿霉素对HepG2细 胞生长的抑制率高、诱导细胞凋亡发生的形态学改变明显、细胞凋亡率高，且联合用药组中随着甘 草素剂量的增加，细胞生长抑制率不断增高、致密浓染或碎片浓染的细胞数逐渐增加、细胞凋亡率 不断增高，具有一定的剂量效应关系。甘草素与阿霉素联合用药引起细胞浆内细胞色素C增多、 caspase-9前体裂解为37/35kDa的片段、caspase-3前体裂解为17kDa的片段，且联合用药组中随着 甘草素剂量的增加，裂解片段显著增多。结论 甘草素能够有效增强阿霉素对人肝癌HepG2细胞生 长的抑制作用及诱导细胞凋亡的作用，其机制可能是改变线粒体膜通透性，促使细胞色素C释放， 进而引起caspase-9、-3级联反应，最终诱导细胞凋亡。 [关键词]甘草素；阿霉素;肝癌;增殖；凋亡；线粒体凋亡通路 cytochrome Signaling 甲叉双丙烯酰胺，过硫酸铵(国产AR试剂)。 1．I．3仪器与设备 细胞培养超净台：恒温C02细胞培养箱(14ERA 倒置荧光显微镜(OLYMPUS，日本)：OLYMPUS inflniteM200)：流式 温水槽)：垂直消毒锅(TH．3560)：液氮罐(美国CBS)：紫外-荧光酶标仪(TECAN 装置(Bio-Bad)；摇床(THZ．C恒温震荡器)。 1．2方法 1．2．1细胞培养及处理 人肝癌HepG2细胞为南京医科大学公共卫生学院营养与食品学系实验室保存。细胞接种于含 恒温细胞培养箱中培养。待细胞长满至培养瓶(皿)约90％左右时，用O．25％胰蛋白酶溶液进行消 化、传代，取生长状态良好的细胞进行实验。 1．2．2 MTT比色法 取生长达90％的人肝癌HepG2细胞，用0．25％胰蛋白酶溶液消化后制成单细胞悬液。将制备好 IJM) 以每组6个孔OD值的平均值作为各组的平均OD值，并根据下列公式计算三种甘草素联合阿霉素 1．2．3 Hoechst33258荧光染色法 同剂量的甘草素(终浓度为200，400 pM)和固定剂量的阿霉素(终浓度为l肛M)各200弘l。将6孔培养板 每孔加入0．5ml固定液，40C过夜后吸尽固定液，用预冷的生理盐水洗两遍，每次3mjIl。每孔加入 0．5mlHoechst 滴一滴抗荧光淬灭封片液后于荧光显微镜450nm波长处观察细胞凋亡的形态学变化并拍照。 1．2．4Annexin V．PI双染法 传代生长达80％的人肝癌HepG2细胞接种于中皿内，加入含10％胎牛血清的DMEM培养液， 置于370C、5％C02恒温培养箱中孵育12h待大部分细胞贴壁后，加入不同剂量的甘草素(终浓度为 min，经流式细胞仪分析细胞凋亡率。 悬液中加入5山AnnexinV—FlTC和5¨lPl，并避光染色15 1．2．5蛋白免疫印迹法(weste加blot) 盒测定所提蛋白浓度。SDS．PAGE电泳，转膜：封闭l h后加一抗，4。C孵育过夜：洗膜后加二抗， 室温孵育