miRNA表达载体的构建和抑制禽流感病毒(AIV)复制的研究.pdfVIP

中国畜牧兽医学 畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学 兽医免疫分 第七次研讨 会论文集 miRNA 表达载体的构建与抑制禽流感 病毒(AIV)复制的研究 1 1 1 1，2 1 孟庆文 ，刘 丹 ，秦红刚 ，李文超 ，曲连东 ( 1. 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 农业部实验动物质量监督检验测试中心，黑龙江 哈尔滨 150001 ； 2. 新疆农业大学 动物医学学院，新疆 乌鲁木齐 830052) 摘 要：miRNA 是一类内源性的长约21 nt 25 nt 的短序列非编码单链RNA ，可以通过部分互补或者完全 互补结合到目的靶mRNA ，以诱发蛋白质翻译抑制(翻译抑制子) 或者介导目的mRNA 的降解调节基因表达。根 据这一特性，设计靶向禽流感病毒的 miRNA 编码序列，使之与靶mRNA 完全互补。将其克隆到 pcDNATM 6 .2-GW/EmGFP-miR 载体中，构建单个或多个串联 miRNA 表达载体，分别为pcDNA6 .2/NP 、pcDNA6 .2/PA 、 pcDNA6.2/PB2 、pcDNA6 .2/PA+NP 和pcDNA6.2/PA+NP+ PB2 。鉴定正确后，将重组质粒转染MDCK 细胞，禽流 感病毒 A/Goose/Guang dong1/96 (H5N 1)感染细胞。荧光显微镜判断转染效率，血凝(HA) 试验和 Real-time RT- PCR 检测抑制效果。荧光显微镜结果表明，重组质粒转染效率达60 % ；试验血凝(HA)试验结果表明，重组质 粒均能抑制流感病毒的复制，以pcDNA6.2/PA+NP+ PB2 的抑制效果最佳，它 抑制流感病毒增殖的能力分别 62.5 % 、50 % 、62 .5 %和75 % 、81 %；Real-time RT-PCR 结果表明，多个miRNA 串联起来比单个miRNA 有较 高的抑制流感病毒复制的效果。 ； 关键词：miRNA ；串联表达；病毒抑制 AIV 禽流感病毒属正粘病毒科流感病毒属A 型流感 mRNA [4] 。且研究表明有些 miRNA 也能直接介导 [5] 根据 ， 病毒(Influenza virus) ，不仅给养禽业造成巨大经济 RNAi 现象 。 miRNA 调控基因表达的特点 [ 1] [2] 损失 ；还严重威胁人类健康 。所以如何有效地预 用人工设计可导入的小RNA 来研究抗病毒的基因 防和控制禽流感成为全球热点。目前 要通过疫苗 治疗，有望给这个领域带来新的发展前景。 预防和药物治疗来防控禽流感，但由于禽流感病毒 本研究以H5 亚型AIV NP 、PA 和 PB2 基因为 分 血 基因组为单链负股 RNA 病毒， 8 个节段， 清 靶基因，在序列高度保守区设计了3 对 miRNA 编 型众多、容易发生抗原漂移和抗原转变，所以其疫 码序列，克隆构建了 miRNA