苯酚降解调控蛋白MphR的克隆与其调控机制的研究.pdfVIP

力、苯酚羟化酶、邻苯二酚1，2-双加氧酶酶活的差异，推测off8的功能。其结果，在 受8mM苯酚，而突变株能耐受12mM苯酚。随着苯酚浓度增加，延滞期增长，同一苯酚 浓度下，突变株的延滞期明显短于野生型，液体培养条件下，突变株60h可以将4mM 的苯酚完全降解，而野生型菌株只降解了68％。由此推测off8在苯酚降解过程中起负 词节作用。 苯酚降解调控蛋白MphR的克隆及其调控机制的研究 彭子欣陈明张维王劲林敏 中国农业科学院生物技术研究所北京100081 苯酚等酚类化合物通常发现于工业或其它污水中，对人类健康和生态环境都有巨 大、直接和潜在的危害。某些微生物可经济有效的将此类污染物降解或转化为无机物， 消除其对环境的不利影响。本实验室于2000年从炼油厂排出的废水中分离到一株高效 降解苯酚的菌株醋酸钙不动杆菌PHEA一2，克隆到包含全部苯酚羟化酶基因(口础)的10 蚰片段，在其上游有—个不完整的开放阅读框ORFI，其推导的氨基酸序列和醋酸钙不 反向PCR技术将已知10kb片段向上游延伸了3kb，得到完整的ORFI，序列长1671bp， 编码556个氨基酸，蛋白分子量63，380Da，定名为MphR。 激活蛋白(EBR)成员有很高的相似性，与MopR同源性最高，碱基序列同源性达到68．45％， 氨基酸同源性达到78．75％。NtrC／XylR型调控蛋白的调控系统申，调控蛋白和酚类化合 物相互作用激活降解基因的启动子。调控蛋白结合于启动子的增强子序列(UAS)，当调 控蛋白识别到效应物后，多聚化形成六聚体结合于UAS序列，DNA弯折促使调控蛋白和 RNA聚合酶紧密接触，激活依赖玎5‘RNA聚合酶的启动子转录，表达降解酶。这种蛋白 在结构上从N端到C端分为具有相应功能的A、B、C、D四个独立的结构域：化学信号 域、链接域、KNA聚合酶激活域和DNA结合域。对这个家族的调控蛋白分析表明，效应 物在A域的结合导致C域的脱阻抑，阻抑物的释放使C域结合ATP，接着在UAS序列发 生ATP驱动的多聚化和脱多聚化，促使盯“RNA聚合酶和盯5‘启动子形成开放复合物， 起始基因表达。 源性最高达72％，但它们的效应物识别谱不同。苯酚存在对，MphR在大肠杆菌中可以 理一致。MphR识别苯酚效应物后结合于P。，激活它的表达，凝胶阻滞试验验证了MphR 和P。的结合。 序列，调控蛋白结合的UAS序列在一24／一12位点上游100bp左右，由两个反向重复序 列(IR)组成，每个IR长16bp，两个IR间隔29到42bp，根据这些特点推测出启动 子基本组件的大致位置。通过巢式PCR分别对启动子区5’和3’端逐段截短确定了启 动子组件的准确位置和其最小功能区域为220bp。5’端第一个IR序列左臂的缺失导 致启动子功能完全丧失；3’端至少需保留起始密码子ATG后20个碱基序列。凝胶阻滞 试验进一步证明截短UAS序列的启动子片段不能与调控蛋白结合，研究结果显示MphR 通过与苯酚信号分子的相互作用，激活苯酚羟化酶启动子，调控表达苯酚的降解代谢途 ● ● 径。 运动发酵单胞菌果聚糖蔗糖酶保守区氨基酸残基突变对其产 物聚合度的影响 周正富李淑英张维林敏 中国农业科学院生物技术研究所北京100081 100