刘敬忠临检培训基因扩增技术在遗传病基因诊断中的应用临检培训班.pptVIP

基因扩增技术在遗传病基因诊断中的应用 刘敬忠 首都医科大学附属北京朝阳医院 北京基因诊断实验室 北京朝阳医院法医物证司法鉴定所 中心法则 复 转录 翻译 DNA RNA 蛋白质 蛋白 制 反转录 糖蛋白 脂蛋白 酶类 激素 细胞因子 基因重组技术 基因探针技术 基因重组药物 基因诊断 基因治疗 PKU 尿毒症（口服artificial cells) 基因诊断 运用基因探针， PCR技术等探测特定靶基因的存在与否，或是否有基因突变等缺陷，从而对疾病或病原体感染作出诊断叫基因诊断。 基因型 表 型 基 临 血 生 细 影 病 因 床 清 化 菌 像 理 诊 学 学 学 学 学 断 诊 诊 诊 诊 诊 诊 断 断 断 断 断 断 基因诊断的特点 灵敏度高（早期） 特异性强 操作简便 取材大多不受组织器官限制 可进行早期诊断，症状前诊断及产前诊断 检测细菌内病毒等微生物时不需培养 聚合酶链反应Polymerase Chain Reaction（PCR） Kary B. Mullis 1984 年问世, 成为分子生物学和生命科学发展史上的里程碑 1993 荣获诺贝尔奖 Mendocin 128号公路附近一棵七叶树下的突发奇想 专利官司之战: DuPont 与Cetus对薄公堂 PCR 原理示意图 PCR技术的应用 一、在分子生物学研究中的应用 二、遗传病的基因诊断和产前基因诊断： 血友病、 地中海贫血、DMD、PKU等等 三、细菌、支原体、衣原体、立克次体等 四、病毒 五、白血病、肿瘤 六、骨髓移植、器官移植供体配型选择 七、法医学 八、动植物学 九、古人类学、古生物学 PCR原理示意图 热变性：从外周血白细胞或绒毛、羊水细胞提取的DNA约1ug，在含有适当缓冲液、引物、dNTPs（dATP、dCTP、dGTP及dTTP）等的反应混合物中，在94℃下热变性4分钟，使之解为单链。 退火：然后置反应混合物于55℃，使引物与解为单链的DNA上互补序列杂交在一起，称之为退火。并迅速加入2单位耐热的Taq DNA聚合酶，混匀、离心10秒钟。为防止在整个PCR过程中，水份的蒸发影响PCR效果，通常加入35ul石蜡油封盖液面。 引物延伸：置上述反应混合物于70℃水浴中1-2分钟，在DNA聚合酶催化作用下，以dNTPs为原料（底物），从引物的3’端A开始, 沿着5’→3’的方向，合成每条模板的互补链，此称引物延伸。结果，DNA拷贝数增加了一倍。 接着，将上述热变性—退火—引物延伸（称为一个循环）反复进行30-35次。只是热变性的时间缩短为1分钟左右。每经过一个循环，DNA拷贝数便增加一倍（×2）。因此，如进行n次循环，则拷贝数将增加2n倍！进行25个循环，则拷贝数将增加225倍，即上百万倍。在琼脂糖凝胶电泳上可看到特异性长度的扩增带。可见PCR之所以高速扩增的关键是因为每次新合成的DNA链在后来的循环中都可以作模板，犹如滚雪球，数量迅速增加。 如果引物5’端有几个与模板DNA不配对的碱基，仍可能与模板DNA退火、延伸，对PCR效果影响不大。这一特点，可使PCR产物两端带上限制酶的Linker，或造成DNA顺序的缺失、插入、碱基替代等。大大增大了PCR技术的应用范围。 影响PCR效果的重要因素及注意事项： PCR技术的原理似乎非常简单明了，PC