凋亡细胞的生化检测技术.pptVIP

輔英科技大學暨教育部顧問室「生物及醫學科技人才培育先導型計畫」醫衛分子檢驗學分班課程 細胞凋亡標幟物分析技術實驗 授課教師： 周致中(輔英生技)/沈金德(進階) 許貞雅(輔英生技) /周書旭(台灣儀器) 林建源(岑祥)/林俊弘(美嘉儀器) 黃麗文(美商必帝) /劉益年(美商必帝)開課時間： 97/7/28~8/1 教室： 實驗大樓c708 細胞凋亡標幟物分析技術實驗 7/28 細胞凋亡與疾病 7/29 細胞計數與活性判斷 7/30 凋亡細胞的生化檢測技術 7/31 酵素免疫分析檢測技術 8/1 流式細胞技術在凋亡細胞 分析上的應用 凋亡細胞的生化檢測技術 授課教師：周致中(輔英生技) 細胞死亡 Cell Death 指細胞受到損傷且影響到細胞核時，細胞會呈現代謝停止、結構破壞和功能喪失等不可逆變化的現象。 Majno, G. and I. Joris, Apoptosis, oncosis, and necrosis. An overview of cell death. Am J Pathol, 1995. 146(1): p. 3-15. 偶發性細胞死亡(Accidental cell death) 細胞凋亡(Apoptosis) 細胞的死亡形式 細胞死亡的形式簡單歸納成兩種致死細胞方式：他殺(Death by murder)與是自殺(Death by suicide) 。 是經由外物而造成的死亡，也就是偶發性細胞死亡(Accidental cell death)或細胞壞死(Necrosis) 。 細胞經由自殺(Cell suicide)的手段所造成的死亡，生理性細胞死亡(Physiological cell death) 、程序性細胞死亡(Programmed cell death) 、或稱為細胞凋亡(Apoptosis)。 偶發性細胞死亡(Accidental cell death) 細胞壞死(Necrosis) 缺血性細胞死亡(Ischemic cell death)是偶發性細胞死亡的代表，通常會伴隨著細胞腫脹的現象，Guido Majno和Isabella Joris認為這樣的現象應該被稱為「腫脹性壞死(Oncosis)」或凝固性壞死(Coagulation necrosis) 細胞之所以會有腫脹的現象，是因為細胞在缺乏ATP的幫助下，致使離子幫浦失調的緣故。 「腫脹性壞死」和「細胞凋亡」是兩個相對的現象，因為腫脹性壞死會有大水泡(Blebbing)與引發發炎反應，而細胞凋亡則是水泡出芽(Budding)現象。 細胞壞死(necrosis) 細胞壞死(necrosis)是因病理而產生的被動死亡，如物理性或化學性的損害因子及缺氧與營養不良等均導致細胞壞死。 壞死細胞的膜通透性增高，致使細胞腫脹，細胞器變形或腫大，早期核無明顯形態學變化，最後細胞破裂。 另外壞死的細胞裂解要釋放出內含物，並常引起炎症反應；在癒合過程中常伴隨組織器官的纖維化，形成瘢痕。 necrosis與apoptosis的圖 細胞凋亡的生化特徵 Biochemical Phenotypic Changes ?Calcium influx, pH changes (0.5 - 1 h) ?Energy pump shuts off (0.5 - 1 h) ?Mitochondria depolarization (1-3 h) ?Caspase-3 activation (2-3 h) Apoptotic Phenotypes Morphological disintegration Plasma membrane loses asymmetry (1-2 h) DNA fragmentation (6-8 h by TUNEL, 12-24 h by Hypoploidy Analysis) Cell shrinkage (12-24 h) Chromatin condensation (18-36 h by gel analysis) Cells are phagocytosed before loss ofmembrane integrity -No inflammatoryresponse 細胞凋亡的過程大致可分為以下幾個階段： 1. 接受凋亡信號→ 2. 凋亡調控分子間的相互作用→ 3. 蛋白水解酶的活化（Caspase）→ 4. 進入連續反應過程 1．凋亡的啟動階段 1）細胞凋亡的膜受體通路： Annexin V法 粒線體膜勢能的檢測法 細胞凋亡相關蛋白質(bcl-2, bad…)測定 2）細胞色素C釋放和Caspase