基因突变重组与检测技术.pptVIP

末端合成终止法 (sanger法)原理 DNA甲基化的检测 　DNA经亚硫酸氢盐硫化处理后,DNA双链中的C转化为U，通过随后的PCR，将U转化为T，但亚硫酸氢盐不能使已发生了甲基化的 DNA的C发生上述转化，PCR后仍保持为C 融合基因的检测 淋巴细胞白血病 t(9;22): BCR - ABL t(12;21): TEL - AML1 t(1;19): E2A - PBX1 t(4;11): MLL - AF4 髓细胞白血病 Inv(16):CBF - MYH11 t(8;22): AML - ETO t(9;22): BCR - ABL 融合基因的测序结果 前列腺癌细胞中TMPRSS2-ERG融合基因检测 （测序法） 纯合子和杂合子的测序结果 异常测序结果的解读 含有插入或 缺失突变 模板不纯 传统测序方法存在长度限制 高通量测序介绍 高通量测序的海量数据分析 基因组学研究 大大降低了测序成本，同时提高了测序效率； 每个flow cell有8个通道 一次单通道的测序可以获取至少500万个读数 每次运行实验可读取10亿个碱基/flow?cell? 可精确读取重复序列 样本使用效率极高，所以对少量样本也可以极灵敏精确地检测 每次测序长度为200 bp左右? 谢 谢 * * * * * 左下角处有超级链接到配伍末端 * 第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表株； 用罗马数字表示发现的先后次序。 命名 Hin dⅢ 属 系 株 序 Haemophilus influenzae d株 流感嗜血杆菌d株的第三种酶 Ⅱ类酶识别序列特点—— 回文结构(palindrome) 切口 ：平端切口、粘端切口 GGATCC CCTAGG Bam HⅠ GAT CTA G CCTAG GATCC G + GGATCC CCTAGG EcoRV GATATC CTATAG ATC TAG + 平端切口 粘端切口 不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接 Eco RⅠ切割位点 Bg lⅡ切割位点 + EcoRⅠ+ Bg lⅡ 双酶切 Eco RⅠ+ Bg lⅡ 双酶切 T4 DNA连接酶 15oC 重组体 配伍末端的连接情况和同一限制酶切位点连接相似。 重组DNA技术操作的主要步骤 载体 质粒 噬菌体 病毒 目的基因（外源基因） 基因组DNA cDNA 人工合成 PCR产物 限制酶消化 开环载体DNA 目的基因 连接酶 重组体 转化 体外包装，转染 带重组体的宿主 筛选 表型筛选 酶切电泳鉴定 菌落原位杂交 大肠杆菌表达系统 酵母 表达系统 哺乳细胞表达系统 几种不同的蛋白表达系统 重组DNA医药产品 产 品 功 能 组织胞浆素原激活剂 抗凝 血液因子VIII 促进凝血 颗粒细胞-巨噬细胞集落剌激因子 剌激白细胞生成 促红细胞生成素 剌激白细胞生成 生长因子(bFGF, EGF) 刺激细胞生长与分化 生长素 治疗侏儒症 胰岛素 治疗糖尿病 干扰素(? 1b, ?2a, ? 2b, ?) 抗病毒感染及某些肿瘤 白细胞介素 激活、剌激各类白细胞 超氧化物歧化酶 抗组织损伤 单克隆抗体 利用其结合特异性进行诊断试验、肿瘤导向治疗 乙肝疫苗(CHO, 酵母) 预防乙肝 口服重组B亚单位菌体霍乱菌苗 预防霍乱 目 录 酵母人工染色体 (yeast artificial chromosome, YAC) 细菌人工染色体 (bacterial artificial chromosome, BAC) 动物病毒DNA改造的载体 （如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒） 其他 人工染色体 染色体要确保在细胞分裂中保持稳定，必须要能够自我复制和向子细胞中平均分配。它需要3个关键序列，包括 自主复制DNA序列（autonomously replicating sequence，ARS） 着丝粒DNA序列（centromere DNA sequence，CEN) 端粒DNA序列（ telomere DNA sequence, TEL） 人工染色体 将3个关键序列用分子生物学方法拼接起来就得到人造微小染色体（artificial minichromosome），在大片段DNA分子的克隆、基因组分析、基因功能鉴定、基因治疗以及研究染色体结构与功能关系等研究中得到了广泛的应用，具有极为重要的价值。目前，正在研究或应用的有： 酵母人工染色体(yeast artificial chromosome,YAC) 细菌人工染色体（bacterial artificial