应用原位放射免疫技术检测目的基因克隆.pdfVIP

．j,i}jjFIEREDITA毯Bciji=g〕一全二」工＿兰七卫王1987 应用原位放射免疫技术检测目的基因克隆’‘ 于秀琴 马清钧 军〔事医学科学院基础医学研究所，北京） 遗传工程技术促进了基因结构和功能的分 4.溶液 析、生产具有经济效益的蛋白质的研究。在获 (1)裂解缓冲液：20mMpH6.8磷酸盐缓 得大量的基因重组克隆中，如何检测和筛选出 冲液，25mg/mlSDS,6mg/ml溶菌酶。 含有目的基因的克隆，是遗传工程的重要技术 (2）封闭溶液：100mm甘氨酸，140mM 之一。目前常用的方法是利用DNA-DNA或 NaCl,10mM磷酸盐缓冲液，pH7.0o RNA-DNA杂交的基因探针检测目的基因， (3)CS/PBS缓冲液：10mm磷酸盐缓冲 但它必须获得特异的基因。在缺乏特异的基因 液，pH7.0,140mMNaCI,5多胎牛血清。 探针时，近几年来建立了免疫探针检测筛选 (4)PBS洗液：10mm磷酸盐缓冲液，pH 法[2-61，它是将目的基因编码的多肤抗原制备成 7.0,140mM NaCl,, 抗体，直接从基因克隆库中筛选能表达 目的基 5．同位素 ‘I-Nal,aP-dATP 为 因的克隆。 Amersham 公司产品。 我们建立了原位放射免疫分析方法，通过 二（）方法 与抗血清反应，将抗原结合在澳化氢活化的滤 1．原位放射免疫分析 参照文献(4]进 纸上，随后与 25‘1标记的抗血清反应，经放射自 行。 显影进行检测。此法已用于鉴定克隆的霍乱毒 2.菌落原位杂交 按照文献 【1]进行。 素基因，结果敏感、特异、可靠。 CT基因探针的制备是将 pCT332质粒 英（国 Greenaway博士赠送）用XbaI/BgLII酶解，以 材 料 和 方 法 02P-dATP亥以蚀置换法分离含有霍乱毒素A,B 一（）材料 亚单位基因的1.8kb片段，比强为2X10cpm/ 1.菌株 01群霍乱弧菌569B，埃尔托 ,ccgDNA,c 178,179，非01群霍乱弧菌 037,057,054, 3。被动免疫溶血试验 参照 Serafiml81 N53，均由卫生部药品生物制品检定所供给，01 方法进行。 群无毒株 1196-78,1074-78，由美国Mas博‘士 4.ELISA 分析 参照Sack方法进行。 馈赠。 结 果 与 讨 论 2.毒素和抗血清 霍乱毒素 C（T）为 一（）原位放射免疫法的敏感性 Sigm。公司纯毒素制品。抗霍乱毒素兔血清， 系由本实验室应用 Sigma公司纯毒素免疫家 YuXiuginetal:InsittaRadioimmunoassay for 兔获得。辣根过氧化酶标记的抗雷乱毒素IgG, DetectingGeneClones 国家自然科学基金资助的课题。 由浙江省防疫站鲍行豪先生馈赠。 1)本工作承黄翠芬教授指导；刘传喧同志提供抗霍乱毒 3.澳化氢活化纸 使用 Wbatman-541 素兔血清；浙江省防疫站鲍行