蓝藻正反义pepcA基因导入对大肠杆菌中脂类合成的调控.pdfVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００８，２８（５）：５２～５８ 蓝藻正反义ｐｅｐｃＡ基因导入对大肠杆菌中 脂类合成的调控 １ １，２ １ １ １ 侯李君 　施定基 　蔡泽富 　宋东辉 　王学魁 （１天津科技大学海洋科学与工程学院　天津　３００４５７　２中国科学院植物研究所光合作用研究中心　北京　１０００９３） 摘要　为了探索原核生物中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（ＰＥＰＣ）在调控脂类代谢中的作用。ＰＣＲ 法扩增了鱼腥藻Ａｎａｂａｅｎａｓｐ．ＰＣＣ７１２０ＰＥＰＣ基因中含保守结构域Ｆａ的一段基因片段ｐｅｐｃＡ，并 将其克隆到ｐＭＤ１８Ｔ载体上。将ｐｅｐｃＡ正反向连接到穿梭表达载体ｐＲＬ４８９上ＢａｍＨＩ位点之 ? ? 间，构建得带有ｐｅｐｃＡ正反义基因的载体 ｐＲＬＳｅｎｐｅｐｃＡ和 ｐＲＬＡｎｔｉｐｅｐｃＡ，转化入大肠杆菌 ? ? （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）ＤＨ５ 宿主细胞中。分析结果表明：ｐｅｐｃＡ片段的转入对宿主菌的生长影响不大； α 与野生型细胞相比较，转反义ｐｅｐｃＡ片段Ｅ．ｃｏｌｉ中ＰＥＰＣ酶活性降低到野生菌的３０．２％，蛋白合 成减少２３．６％，脂类的合成增加了４６．９％，；而转正义ｐｅｐｃＡ片段Ｅ．ｃｏｌｉＰＥＰＣ酶活性是野生菌的 ２．３８倍，蛋白合成增加了１４．５％，脂类合成减少了４９．６％；转基因菌中十八碳酸的含量明显增 加。上述结果可能为利用原核生物做生物柴油原料提供线索。 关键词　蓝藻　大肠杆菌　磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（ＰＥＰＣ）　脂类　调控　生物柴油 中图分类号　Ｑ７８９ 　　磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（ＰＥＰＣ；ＥＣ４．１．１．３１） ２００５年，赵桂 因在油菜中的表达，得到了高产油油菜； ［９］ 存在于所有进行光合作用的有机体中，包括高等植物、 兰 等用农杆菌介导法将反义ｐｅｐｃ基因导入大豆的基 绿藻、蓝细菌和光合细菌。在大多数非光合细菌和原 因组，获得了稳定的超高油转基因大豆品系。在原核 生动物中也存在这种酶，但动物、真菌和酵母中不存 生物中，主要是用Ｅ．ｃｏｌｉ来研究ＰＥＰＣ的结构、功能、性 在［１，２］。在Ｃ 和ＣＡＭ植物中，ＰＥＰＣ负责无机碳的初 质和代谢途径。关于ＰＥＰＣ表达调控的研究多是用正 ４ ［３～５］ ２＋ 向调控来合成一些有用的氨基酸，如 １９９３年，Ｃｈａｏ 始同化 ，在Ｍｇ 存在下它催化磷酸烯醇式丙酮酸 ［１０］ ? 等 研究了ＰＥＰＣ在Ｅ．ｃｏｌｉ中的过度表达对其产量的 （ＰＥＰ）和ＨＣＯ 反应生成草酰乙酸，并且释放 Ｐｉ。另 ３ ［１１］ 影响；１９９６年，Ｍｉｌｌａｒｄ等 研究表明ＰＥＰＣ在 Ｅ．ｃｏｌｉ 外，ＰＥＰＣ的其它几种非光合型的同工酶还参与氨基酸 ［６］ 中的过度表达可以加强琥珀酸的合成；而负调控一般 代谢途径中碳骨架的回补作用等 。对脂类代谢而 是为了研究ＰＥＰＣ的性质、功能，如 １