神经生物学实验课细胞培养1.ppt

细胞培养 基本概念 原代培养 源自体内新鲜组织的细胞在体外条件下生长，在传代之前称为原代培养。 传代培养 细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新的培养器皿中。 在实验过程中，根据要求可始终保持细胞的活力，并可长时期的监控、检测甚至量评估一部分活细胞的情况，包括其形态、结构和生命活动等。这点是其他方法所无法取代的。 进行体外的细胞培养实验时，可以根据需要，控制物理化学的条件进行实验、观察。 （包括PH、温度、O2、CO2、实验用的药物、试剂等） 通过细胞培养所得到的细胞系属同一类型的细胞，可以达到均一性。利于单一细胞实验的定性和定量统计。 通过倒置相差显微镜外接照相,摄影等直接观察活的细胞；电子显微镜分析细胞的超微结构；同位素标记、放射免疫等方法检测细胞内物质的合成、代谢的变化等、通过激光共聚焦，荧光显微镜等来观察细胞内的物质的变化及检测细胞的凋亡等。 多种学科均可利用细胞培养进行研究，如：细胞学、免疫学、肿瘤学、生化学、遗传学、分子生物学等。可供实验的组织来源众多，包括各种动物的各类组织，可以是动物的胚胎或成体，可以是正常组织或肿瘤组织等。 细胞培养可以大量提供在同一时期、条件相同、性状相似的实验样本，因此有时可比体内实验经济的多。例如，一个需要100只鼠才能得出结论的实验可能用100片盖玻片或几个多孔培养板而获得具有相同统计学意义的结果。 四、实验准备 实验准备是细胞培养成功的重要前提条件。 实验准备： 1、将实验所需要的一切“硬件”都准备齐全。 2、确保细胞培养所需的一切“硬件”达到无 菌的要求。 1、实验所需仪器设备（无菌室）： 超净工作台，压力蒸汽消毒器，电热干燥箱， 滤器，酸缸 CO2培养箱 倒置显微镜 液氮罐 自动双重纯水蒸馏器或纯水仪 超净台 滤 器 CO2培养箱 2、实验所需培养器皿： 培养瓶 培养皿 吸管 冻存管，等 3、实验所需手术器械： 剪刀 大镊子 直头和弯头眼科镊子 直头和弯头眼科剪等 4. 细胞培养用液 （1）培养基 （2）消化液 （3）清洗液 培养基 培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长的溶液，分天然培养基和合成培养基。 天然培养基： 天然培养基有血清、血浆和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。 优点：营养成分丰富，培养效果好 缺点 （1）来源受限。 （2）成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析。 （3）易发生支原体污染。 合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。目前已设计出许多种培养基，如TC199、MEM、RPMI-1640、 DMEM等。 主要成分：氨基酸、维生素、碳水化合物、 无机盐和其它一些辅助物质。 优点：标准化生产，组分和含量相对固定，成本低 缺点： 缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。 人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量的天然培养基（如血清）。 一般说来．含5％小牛血清的培养基对大多数细胞可以维持细胞不死．但支持细胞生长一般需加 10％血清． 血清质量好坏是实验成败的关键。 常用血清有胎牛血洁、新生牛血清、小牛血情、兔血清、马血清等，其中以胎牛血清质量最好。 优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、病毒污染。 血清的灭活（消除补体活性）：56 ℃ ，30 分钟 血清的消毒：过滤除菌 在培养液配制后，培养液内常加适量抗菌素，以抑制可能存在的细菌的生长。 通常是青霉素和链霉素联合使用。培养基内青霉素、链霉素最终使用浓度为每毫升100单位。 庆大霉素：每毫升100单位——方便、广谱、稳定 完全培养基的组成 基础培养基 80％一95％ 血清 5％一20％ 碳酸氢钠 2.0 g/L 青、链霉素 各100卑位／毫升 培养基的配制 RPMI-1640 培养粉 1袋 碳酸氢钠 2.0 g 青、链霉素 各100单位／毫升 加三蒸水 至 1000ml,