桑树青枯病菌紫外分光度计菌方法研究.pdfVIP

中国蚕学会桑树病虫害防治学术研讨会论文集 桑树青枯病菌紫外分光度计茵方法的研究 唐翠明 王振江 邝哲师 吴福泉 罗国庆 杨琼 (广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所，广州510610) 摘要：采用紫外分光度法测定了广东省几个桑树青枯病主发地区的青枯病菌菌液浓度，建立了青枯病菌紫外 分光度法对平板记数法的标准曲线，通过分析结果表明青枯病菌苗液浓度在109。1011 ofu／mL之间时，标准曲 线线性关系良好，此方法可用于桑树细菌性青枯病菌苗液的快速粗略计数。 关键词： 桑树； 分光光度计； 青枯病 bacterial 桑树青枯病(Mulberry 束病害，是一种毁灭性的桑树细菌性病害，具有发病急、蔓延快和死亡率高等特点。该病最早 于1968年在广东省顺德县发现，给该省蚕桑生产造成了严重威胁，近年来桑青枯病的发病范围 逐渐扩大，已在广西、浙江、江西等省的部分蚕区流行发生，如果任其蔓延，该病将成为未来 影响我国蚕桑业发展的一个制约性因素。但迄今为止，对桑树青枯病的防治还没有一个有效的 方法和药剂，只能通过传统的抗病育种方法进行防治。在传统的抗病育种方法中，在进行品种 材料抗性鉴定时，必须要知道菌液的浓度，用普通的平板计数法，往往不能满足时效性，因此 找到一种快速计数桑树青枯病菌的方法将为科研提供极大便利。本文通过研究紫外分光度法和 平板计数法间的关系，绘制紫外分光度法和平板计数法标准曲线，建立一种能快速计数的方法。 1材料与方法 1．1材料 UV-1700紫外分光光度计(日本岛津)，电子天平，离心机，青枯病菌桑根(广东省主蚕 5 区青枯病地采集)；LB培养基：每1000mL中含蛋白胨59、NaCIg、酵母膏3g。 1．2方法 1．2．1青枯病菌的培养 将从广东省各主蚕区采集到的自然发病的植株，将根部木质部切成2～3cm长的小段，用75 ％的乙醇消毒数分钟，然后浸泡于无菌水中，有乳白色液体流出，用此菌液接种杂交桑塘10x 伦109植株表现明显的青枯病症状，再将此病株根部木质部切成2～3cm长的小段，在无菌水 中浸泡后用接种针取悬浮液在马铃薯培养基上划线培养，2d后，挑取具流动性的乳白色圆形单一 菌落在TZCA培养基上再划线培养，选取菌落边缘乳白色，中心呈粉红色的单一菌落，此为致病 菌，将该菌斜面培养24h，最后接种到200mLLB培养基中扩大培养，置于37。C摇床中振荡培 h。 养24 1．2．2菌液吸光度的测量 分别取扩大培养所得的青枯病菌液20mL，置于离心机中，5000r离心10min，白色病菌 沉淀用双蒸水冲洗3次，最后再定容到20mL，然后分别稀释l、2、3、4、5倍后，在600nm下 测量并记录吸光度值。 110 中国蚕学会桑树病虫害防治学术研讨会论文集 1．2．3平板闲落计数法测青枯病活菌浓度 按上述方法将细菌扩大培养。梯度稀释至l0-11，然后分别稀释1、2、3、4、5倍后，取 15块LB平板培养基，分别从每个稀释度的菌液中，取200止，用平板涂布法，涂于平板中， 标明稀释度，每个稀释度涂3块平板。37C培养箱培养24h后，可见菌落形成，选取平板上出 现50—500个菌落计数，取平均值，计算出原菌液细菌浓度，作为细菌菌液的标准浓度。 2结果与分析 吸光度与活菌浓度之间的关系，即要测定青枯病菌浓度与此浓度下青枯病菌液体在波长 60011m下的吸光度之间的关系。根据朗伯比尔定律： A=EcL A：吸光度值 c：液体的浓度 E：吸光常数 L：光程 其中E为定值，L为比色杯厚度为lcm，故吸光度值A与浓度c成正比关系，斜率即为 EL。在一般科研试验中，所用青枯病菌为对数生长期时的菌液．处于此期的细菌，活菌量远大 于死菌量，故可近似认为菌液的浓度即为活菌浓度．。 对同一采集地青枯病菌液同时测吸光度值与进行平板菌落计数，将平板菌落计数所得菌液 浓度作为细菌标准浓度C．根据所测出A值以及相对应的标准浓度c值，通过公式A=EcL可算 出E值．重复测量，得出多组E值，取平均值即为最终E值，将E值带入公式