禽副粘病毒-2膜融合相关多肽的克隆表达和活性研究.pdfVIP

。。。囝 2004学术年会 酶polI和具自我剪辑功能的核酸酶Rib，可从病毒基因组cDNA转录获得末端完整精确的病毒基因 毒功能蛋白，启动病毒的复制周期。这种8质粒系统与传统的RNP一辅助病毒反向基因操作系统相 比成功几率更大，与完全依赖质粒的18质粒或12质粒系统效率也有所提高。利用这一系统，我们 及PR8株6个内部基因的H5N1流感病毒灭活疫苗种子株。 致病力禽流感病毒在抗原性上的高度相似，我们选择GD／1／96作为表面抗原基因HA和NA的供体， 并突变删除了HA裂解位点的连续多个碱性氨基酸，构建了H5N1流感病毒灭活疫苗种毒株，与野 生型GD／1／96相比，不仅抗原性完全一致，而且鸡胚生长特性大大改善，生长滴度提高8倍以上； 该种毒株完全失去对鸡的感染复制能力和致病性，具有高度遗传稳定性，对灭活疫苗的大规模生产 和应用均具有高度的生物安全性和环境安全性。 3．6免疫和攻毒保护试验进一步证明Rel具有优良的免疫保护原性，作为防制H5亚型禽流感新型 灭活疫苗种毒株，同时具有高度生物安全、生长滴度高、抗原强的突出优点。 参考文献(略) 禽副粘病毒。2膜融合相关多肽的克隆表达与活性研究 王晓佳，汪明+，赵继勋 中国农业大学动物医学院预防兽医学系，北京100094 毒。APMV-2表面囊膜糖蛋白有两种，即与宿主受体结合的血凝素神经氨酸酶(HN)以及介导病毒 与宿主细胞发生膜融合的融合蛋白(F)。其中F蛋白有两段七肽重复区域(heptadrepeat，HR)，分 段HR区域可相互结合形成六螺旋束卷曲结构以引发病毒与宿主之间的膜融合，而体外合成HR小 分子抑制予可以抑制融合蛋白诱导的膜融合，对一些副粘病毒的研究也得到类似结果。APMV一2膜 融合的相关研究还没有文献报道。 1方法 1．1 learnCoil—VMF软件预测病毒融合蛋白七肽重复区域 将禽副粘病毒一2(APMV一2)F蛋白的氨基酸序列(GenBankAccession No．D13977)输入 酸序列。 1．2引物设计与基因扩增 ‘通讯作者 2004学术年会囝667 酶切位点，下游引物含XhoI酶切位点，且下游引物酶切位点前设终止密码子。以APMV一2融合蛋 个循环；72℃lO分钟。 7 7—3 HRl引物如下：5 上游：A1N嚣巡GccGCCGTGGCTCTCAAT 7 7—3 HR2引物如下：5 上游：GTc鱼鱼鳃要口℃G-C叮GGATATAAGCAGT 1．3基因克隆 将所得PCR扩增产物用BamHI和Xho I双酶切后分别克隆入pGEX，6p．1载体，16。C过夜后转 化大肠杆菌JMl09感受态细胞；随机挑选转化菌单菌落接种液体培养基，提取质粒用BamHI和Xho I双酶切鉴定，能够切出与目的片段分子量一致的质粒为候选阳性克隆，对所得候选阳性质粒进行 DNA测序。 1．4融合蛋白表达及蛋白酶切后纯化 u 隆接种含氨卞青霉素(100 mM mM rnlVl 收集菌体，加适量PBS缓冲液(140NaCl，2．7 InM 7．3) KCI，10Na2HP04，1．8 KH2P04，pH 4B亲和层析柱，再用PBS洗涤亲和柱至少 取上清；将上清通过经PBS平衡的Glutathione．Sepharose 十个柱体积；用至少三个柱体积的还原型谷胱甘肽溶液(10mMreduced Tris．HClDH