万古霉素耐药肠球菌基因型与水平传递研究.pdfVIP

万古霉素耐药肠球菌基因型及水平传递研究 郑波王珊李耘薛峰肖永红 北京大学第一医院f临床药理研究所 肠球菌是院内感染的重要致病菌，可造成泌尿 华美生物工程公司：万古霉素、替考拉宁、氨苄西林、 系统感染、腹腔感染、败血症、心内膜炎、肺部感 四环素、庆大霉素、链霉素、左氧氟沙星、红霉素、 染等，是英国和美国院内感染的第二、三位致病菌。 利福平、呋西地酸和壮观霉素均购自中国药品生物 万古霉素长期以来一直是治疗肠球菌感染的最终选 制品检定所。M—H培养基和脑心浸液(BHI)培养基 择，自1986年在法国分离出第一株万古霉素耐药肠 球菌(vancomycin-resistantenterococcus，VI{E)品，凝胶成像系统为CSYNGENE公司产品。 开始，很多国家相继发生vRE造成的临床感染。欧 3．寡核苷酸引物：寡核苷酸引物委托北京泛基诺 (功能基因组)科技有限公司合成。 洲2000年时肠球菌中VRE的分离率已达到5．8％；美 国1989年时肠球菌中万古霉素的耐药率只有0．3％二方法 一0．4％，2002年和2003年造成院内感染的肠球菌中1．体外敏感试验：采用平皿二倍稀释法分别测定万 万古霉素耐药率达到27．5％-28．5％“’”1。我国近年也古霉素、替考拉宁、氨苄西林、四环素、庆大霉素、 开始有VRE感染的报导“1。VRE已经成为威胁人类生链霉素、红霉素和利福平等抗菌药物对肠球菌的最 命安全的严重问题。 低抑菌浓度(MIc)，按美国l临床实验室标准化委员会 2003年以前我所全国细菌耐药监测嘲仅分离出 两株万古霉素耐药肠球菌，但从2004年至2006年用ⅧI液体培基稀释至每毫升培基含105CFU浓度。用 仅从北京和天津地区即分离出12株VRE，针对这12多点接种仪接种至上述已备好的含序列浓度抗菌药 株VRE我们采用多重PCR方法检测了其耐药基因型，物Ⅲ固体培养基表面。试验以WH003、WH014和 并研究了万古霉素耐药基因在肠球菌间水平传递情 况。 时。24小时后无菌落生长者培养时间延长至48小 材料和方法 时，凡有一个菌落生长者，均判断为该菌株对该抗生 一、材料 素浓度耐药。无菌落生长的MIC即为该抗生素对该 菌株的MIC。 1．菌株：VanA型标准菌株叵faeciⅧWH003 和VanB型标准菌株叵faecaJisWH014(国家细菌耐2．模板DNA的制各：将平皿上的单个菌落用50u1 药性检测中心马越教授惠赠)，万古霉素敏感粪肠球 溶菌酶洗涤，混匀后37℃孵育lO分钟，然后加入 faecalisFA2—2和 50ul蛋白酶K和O．1 7．5)1001．tl 菌标准菌株ATCC29212。E mol／LTris(pH 卫而Pcj∞BM4105RF(日本国立群马大学池康嘉教混匀后37℃孵育10分钟即制成PCR扩增模板。 p 授惠赠)。我国临床分离VREl2株，其中粪肠球菌13．PCR扩增：扩增反应总体积为10l，其中灭菌 株，其余儿株均为屎肠球菌，经常规方法和API法鉴 双蒸水7．1Ⅱl、i0×PCR反应缓冲液1u1、 定。 2．主要试剂和仪器：溶菌酶为美国Sigma公司0．5ul。置于DNA扩增仪上按以下条件进行自动化 DNA多聚 扩增反应：变性，94℃1分钟：退火，54℃1分钟： 产品，蛋白酶K为德国Merk公司产品。Taq marker购自 酶为中国华美生物工程公司产品。