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中国化工学会农药专业委员会第十三届年会论文集 硝基还原酶产生菌的筛选研究 薛章荣 徐文平 旷文丰 陶黎明 (上海市农药研究所，上海200032) 摘要： 硝基还原成氨基是常见的化学官能团反应。将硝基还原酶作为此官能团反应的催化剂，可以使反应条件 变得温和。我们建立了硝基还原酶的筛选模型，从众多菌种中筛到若干只菌株j其发酵液能将间二硝基苯转化成 间硝基苯胺，最高的转化率为6．28％。 关键词：官能团反应 微生物转化硝基还原酶筛选模型 在过去的30多年中，微生物转化技术在有机化学合成领域中的尝试，不仅使理论研究获得广 泛开展，在实际应用方面也取得了长足的进步。许多化学合成工艺相当复杂的药物、食品添加剂、 维生素和一些精细化工产品合成过程中的某些重要反应，目前已经能够用微生物转化技术得以替 代。 用于微生物转化的菌株筛选的范围应该尽可能地广，因为至目前为止已经发现了3000余种能 够催化各种化学反应的酶，其中有些酶的催化效果比化学催化剂好；另外，微生物的多样性和其 生理生化特性的多样性(它们能够修饰和降解许多有机化合物)，使我们有可能找到某种微生物 来催化某种特定的和所期望的化学反应n’。 将硝基官能团催化还原成氨基，是化学反应中的一步常见的步骤。采用化学还原的方法常有 副反应，对于副产物的产生，在控制上存在一定的困难。而生物酶具有生物催化的专一性，不存 在副反应的问题。而且运用微生物转化技术可以使反应能够在常温、常压下温和进行，有利于节 能降耗的开展。 硝基还原酶(nitroreductase)广泛存在于细菌、真菌、原生动物、植物和动物中。 它可以在如下的反应过程中作为生物催化剂幢’。 Ar—NH2 Ar—N02—————◆Ar—NO————◆Ar—NHOH———◆ 间硝基苯胺是一种极为重要的有机原料，广泛用于染料、医药、农用化学品、添加剂、表 面活性剂、纺织助剂、螯合剂以及聚合物、阻燃剂等生产中．也用于松木颜色的检验。 这里我们利用间二硝基苯作为反应底物，用微生物发酵液进行官能团硝基的还原，使之转化 成间硝基苯胺。 1．材料与方法： 1．1菌种来源：系上海南方农药创制中心菌库所保存的菌种 1．2仪器和试剂： ·577· 中国化工学会农药专业委员会第十三届年会论文集 SHIMADZU高效液相色谱 SPD一20A检测器LC一20AT泵 依利特Kromasilc8液相柱 间二硝基苯，间硝基苯胺AR级 三氯乙酸，亚硝酸钠，氨基磺酸铵， N．(1．萘基)乙二胺二盐酸盐均为AR级 1．3能还原间二硝基苯的微生物菌株的初步筛选： 平板培养基：葡萄糖1％酵母提取物O．5％N—ZAmine0．5％可溶性淀粉2％碳酸钙0．1％ 7．2 璩脂2％PH u 在无菌室中将含有最终浓度为20g／mI间二硝基苯的平板培养基倒入预先消毒的平皿中，待 冷却凝固后，把不同的菌种接种于平板之上。培养皿在暗室中37℃放置48小时。然后在每个平 皿中分别加入13毫升0．2l％的三氯乙酸溶液和0．007％的亚硝酸钠溶液，室温下放置20分钟。再 加入1毫升0．5％的氨基磺酸铵溶液，室温下保温3分钟。最后每个碟子中加入5毫升0．1％的N． (1．萘基)乙二胺二盐酸盐溶液，室温下进行观察(孙。 仔细观察平皿中的菌落，凡是染上紫红色的菌株作为下一步复筛的备选菌。 1．4还原间二硝基苯的微生物菌株的复筛 1．4．1发酵培养基：葡萄糖1．5％ 0．2％ NaCl 牛肉膏O．3％酵母膏0．3％蛋白胨0．3％K2m04 0．4％ 0．02％ PH7．2 MgS04 将40毫升的发酵培养基放入250毫升的摇瓶中，121℃下灭菌20分钟。待冷却后，在无菌室 中接入菌种，28℃培养70小时后取出。 分别取0．45毫升的发酵液和50微升的间二硝基苯二甲基亚砜溶液于Eppendorf管中，最终 底物浓度为