RNAi抑制丝状真菌里霉creI基因的表达.docVIP

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2017-08-20 发布于重庆
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RNAi抑制丝状真菌里霉creI基因的表达.doc

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RNAi抑制丝状真菌里霉creI基因的表达.doc

一、pAN-PGT载体的构建： pAN-PSGT是同时携带潮霉素抗性基因表达盒和目的基因表达盒的T载体。由pgpd启动子、CBH I信号肽、lacZ基因和Tcbh终止子构成的表达盒pgpd-LacZ-Tcbh插入质粒pAN7-1构建而成。本实验首先要将pAN-PSGT改造成不含CBH I信号肽的pAN-PGT载体,以利于后续实验的检测作用。大致过程为：设计引物扩增pgpd启动子，将PAN-PSGT载体中带有CBHI信号肽的gpd-CBHI片断替换掉，改造为载体PAN-PGT。（如图1所示） 1、片断gpd的扩增：以插入gpd序列的质粒为模板，gpd3和gpd4为上下游引物PCR扩增gpd序列，并在两端引入HindⅢ、EcoRI酶切位点。上游引物：gpd3(带HindⅢ酶切位点) 5’GCTAAGCTTGACGCAGAAGAAGGAAATCGCC 3’ 下游引物：gpd4：5’ CCGGAATTCCCACACGAGCTGTGGCCATTTTG TATCTGCGAATTGAGCTTG 3’（EcoRI/XcmI位点） 2、HindⅢ、EcoRI双酶切载体PAN-PSGT（已有这两个酶切位点）和gpd片断，切胶回收后连接成载体PAN-PGT。二、DsRed基因片断连PAN-PGT载体，构建成含DsRed的质粒PAN-PReT： 1、DsRed基因片断的扩增：以质粒pDsRed2-N1为模板，Red1、Red2为上下游引物，PCR扩增