免疫组化操作规程及操作流程.docVIP

免疫组化操作规程 一、实验原理与意义 免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通 过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新 技术。它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜(包括荧 光显微镜、电子显微镜)的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋 白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等)。 二、实验器材 微波炉、吹风机、组化笔、湿盒、烤箱、振荡器、染缸、光学显微镜、纯木浆卫生纸、 计时器和通风橱等。 三、试剂配制 1. 0.01 M PBS(pH 7.34 )：9.0 g NaCl + 50 ml 0.2 M PB 加双蒸水至 1000 ml；1000 ml 0.2M PB (pH 7.4)＝5.93 g NaH 2 PO 4 ·2H 2 O＋58.02 g Na 2 HPO 4 ·12H 2 O in 1000 ml 双蒸 水或＝190 ml A + 810 ml B（A. 0.2 M NaH 2 PO 4 ·2H 2 O：15.6 g in 500 ml ddH 2 O；B. 0.2 M Na 2 HPO 4 ·12H 2 O：71.632 g in 1000 ml dH 2 O）。 2. Citrate Buffered Saline（0.01 M 柠檬酸缓冲液，PH6.0）：28 ml A + 72 ml B + 200 ml ddH 2 O（A.Citrate acid（柠檬酸）：10.5 g 加双蒸水至 1000 ml；B.Citrate sodium（柠 檬酸钠）：29.41 g 加双蒸水至 1000 ml）。 3. 细胞通透液：由终浓度分别为 0.3%双氧水和 0.3%Triton X-100 混合而成。配制方 法是先用微波加热的 36 ml PBS，再接着加 120 ul TritonX-100，并加热一会儿，冷 却至临用前加 0.4 ml 30％H 2 O 2 。 4. 5％羊血清或封闭血清，用 PBS 稀释。 5. 含 0.03％H 2 O 2 的 0.05％DAB（避光）：用 20×DAB（1％，10 mg/ml）5 ul＋0.1 ul 30% H 2 O 2 ＋95 ul PBS。 6. 一抗、二抗均用 PBS 稀释。 7. Xylene、梯度 Ethanol（100％×2、95％、80％、70％、50％）、双蒸水、中性树胶 （封裱剂）。 8. 苏木精染液： 四、操作步骤 1 、脱蜡、水化 1) 60 ℃×20 min→Xylene 2 ×10 minutes； 2) 100% absolute ethanol：2 ×5 minutes； 3) 95% ethanol 2 minutes； 4) 80% ethanol 2 minutes； 5) 70% ethanol 2 minutes； 6) distilled water:5 min； 7) PBS 洗 3 次×3 min。 2、细胞通透、封闭内源性过氧化物酶 8) 用封闭通透液浸润切片 30 min（RT 避光）。配法是用预热 40 ml PBS 加 120ul TritonX-100 加热几分钟后，临用前加 400 ul 30％H 2 O 2 。 9) PBS 溶液洗 3 次×3 min。 3、抗原修复暴露抗原决定族 10) 切片放入 0.01 M 柠檬酸钠缓冲溶液（pH6.0）后，在微波炉里高火 4 min 至沸腾 后，再加热约 6 min×4 次，每次间隔补足液体，防止干片。 4、封闭非特异性蛋白 11) PBS 溶液洗 3 次×3 min； 12) 将切片取出,周围水分用滤纸吸干,用组化笔在组织周围画上圈,在圆圈内组织滴 入 5%羊血清（与二抗来源一致）后放入湿盒中,室温 30（10～30）min； 5、一抗孵育 13) 甩去切片上的羊血清,用滤纸擦干组织周围残留血清，直接加入已稀释的一抗（1： 250、500、1000）后，放入湿盒中室温 1 小时，然后 4 度过夜，从冰箱中取出需 37 ℃复温 45 min。 6、二抗孵育 14) 将一抗倒掉并用 PBS 洗 5 min×5 次； 15) 用滤纸将圆圈周围的水吸去，加入已稀释的二抗后放入 37 ℃恒温烤箱中 30 min （回收）。 16) 用 PBS 洗 5 次×5 min； 7、SP 反应 17) 加入 SP 后放入 37 度烤箱中 30 min。 18) 用 P