4-（3′-羟基-4′-羧基苯基）偶氮基邻氯酚药物对炎症模型中iNOS TNF-α及NF-κBp65的作用.pdfVIP

· 42 · 中国药物与临床 2015年 1月第 15卷第 1期ChineseReme~ Clinics，January2015’vo1．15，No．1 4．(3一羟基一4一羧基苯基)偶氮基邻氯酚药物 对炎症模型中iNOSTNF一及NF—KBp65的作用 李卫萍 李元宏 李锦平 赵正保 刘锐玲 溃疡性结肠炎 (uc)是一种慢性反复发作性疾病，病因复 流程进行MTY检测，在490nm波长测定吸光度 (A)值。 杂，难治愈。目前，氨基水杨酸(ASA)类仍是治疗各型炎症性 1．2．1．4 结果计算 肠病 (IBD)的主要药物 1l，如5．氨基水杨酸类 ，但是长期应用 细胞存活率(％)= ×1。。％ 这类药物。不 良反应大，很大程度上降低了患者用药的依从 性和治疗效果。近年来关于4-ASA的研究报道其可治疗 UC 1．2．2 ELISA检测邻氯酚对脂多糖诱导的TNF—和 iNOS的 [2，， 但是4一ASA口服却不易到达结肠 ，大部分在上消化道被 抑制作用 吸收．不能达到应有的疗效。为寻找临床疗效好的4．氨基水 1．2．2．1 细胞常规传代培养 ：细胞用达氏修正依氏(DMEM) 杨酸类药物 ，本实验室合成了4．ASA的系列衍生物，旨在能 高糖培养基培养，换液 1-2d一次，传代2～3d一次，备用。 够到达结肠释放出4-ASA发挥药效，前期的实验也已证实了 1．2．2．2 方法：实验分组：实验设药物低、中、高剂量组 ，同时 其能够到达到达结肠 。本实验的主要 目的是观察4一(3．羟基一 设正常对照组和阳性对照组、脂多糖组 (即模型组)。调整细 4-羧基苯基)偶氮基邻氯酚 (以下简称邻氯酚)的体外抗炎作 胞密度为 1x106／ml，在37℃、5％CO孵箱孵育，待细胞贴壁 用 ，为其进一步实验提供依据。 后 ，药物低、中、高剂量组、阳性对照组和模型组每孔各加脂 1 资料与方法 多糖 (LPS)90 l，正常对照组加等量培养基。培养 1h后，药 1．1 材料与试剂 物低、中、高剂量组每孔加入邻氯酚 1O ，阳性对照组加柳 药物4．(3．羟基-4一羧基苯基)偶氮基邻氯酚是由山西医 氮磺胺吡啶 10 l，其他组加等量培养基，使药物浓度为 10、 科大学药物化学研究所合成的，四甲基偶氮唑蓝 (MYr)从 40、160t~g／ml。24h后，按照试剂盒说明测定上清中iNOS和 Sigma公司购买，二甲基亚砜购 自索来宝有限公司，肿瘤坏死 TNF一0【的含量。 因子 (TNF)一o【与诱生型一氧化氮合酶 (iNOs)酶联免疫吸附 1．2．3 细胞免疫检测邻氯酚对脂多糖诱导的NF．KBp65的作 试验(ELISA)试剂盒由上海瑞齐生物制品有限公司购买，兔 用 抗 鼠核因子 (NF)．KBp65一抗购买于北京中杉公司，快捷型 1．2．3．1 方法：调整细胞密度为 1xlOqml，细胞爬片 ，在 6孔 酶标羊抗鼠，兔 IgG聚合物购 自北京中杉公司．ELX800酶标 板中，每孔滴加 200txl细胞悬液于盖玻片上，37oC，5％CO 仪购 自美国宝特公司。上海细胞库购买 RAW264．7细胞株。 孵箱孵育。实验设正常对照组、模型组 (LPS)、5、10、40、160 1．2 方法 p．gm／l药物组。 1．2．1 MTI法检测邻氯酚对RAW264．7细胞的抑制作用 1．2．3．2 细胞免疫：①取出6孔板 ，倒掉液体，PBS洗2次；② 1．2．1．1 药物的配制：精确称取邻氯酚0．0032g．用二甲基亚 用中性甲醛固定，PBS洗 3次，每次2min；③用3％H20：消除 砜 (DMSO)溶解 ，加无血清培养基至 1ml，稀释得浓度为 内源性过氧化物酶 ；④每孔加 N