番茄黄化曲叶病毒 Rep 基因植物表达载体的构建及对番茄的遗传转化.pdfVIP

江苏农业科学 2015年第43卷第2期 一 41一 裴华丽，刘永光，乔 宁，等．番茄黄化曲叶病毒Rep基因植物表达载体的构建及对番茄的遗传转化[J]．江苏农业科学，2015，43(2)：41—45 doi：10．15889／j．issn．1002—1302．2015．02．012 番茄黄化曲叶病毒Rep基因植物表达载体的构建 及对番茄的遗传转化 裴华丽，刘永光，乔 宁，李美芹，薛其勤，杨天慧 (潍坊科技学院，山东寿光 262700) 摘要 ：克隆番茄黄化曲叶病毒的复制酶基 因(TYLCV—Rep)，并构建其植物表达载体 ，通过农杆菌介导法转入番 茄子叶外植体。经过共培养、潮霉素筛选和分化再生 ，获得21株潮霉素抗性植株。PCR检测和SouthernBlot检测结 果表明，有3株呈阳性检测反应 ，说明TYLcV—Rep基因已整合到番茄基因组中，阳性率为 14．3％。烟粉虱接种试验 结果表明，番茄转基因植株较非转基因植株对番茄黄化曲叶病毒的抗性明显增强。 关键词：复制酶基因；黄化曲叶病毒；番茄；遗传转化；表达载体 中图分类号：s436．412．11 文献标志码：A 文章编号：1002—1302【2015)02—0041—04 番茄在中国各蔬菜产区均有大面积的种植 ，在我国蔬菜 实例还未见报道。本研究从番茄黄化曲叶病毒株中克隆黄化 周年供应中占有非常重要的地位。随着温室大棚的推广及蔬 曲叶病毒的复制酶基因，并将其转入番茄中以期获得抗番茄 菜反季节栽培效益的提高，温室番茄栽培面积连年增长，其病 黄化曲叶病毒植株，从根本上解决当前番茄普遍存在的病害 害的发生也呈现逐步加重的趋势。近年来，在番茄主产区相 问题，尽快培育出适合山东乃至国内主要番茄种植区的抗番 继发现的番茄黄化曲叶病毒，对番茄植株的生长、开花、坐果 茄黄化曲叶病毒株系，以满足 目前番茄产业的需求。 等方面均产生严重的危害，给当地的番茄生产带来巨大的经 1 材料与方法 济损失 J。番茄黄化曲叶病毒 (tomatoyellowleafcurlvirus， TYLCV)属双生病毒科 (Geminiviridae)菜豆金色花叶病毒属 1．1 材料与试剂 (Begomovirus)-7]，是一类世界范围内广泛发生 的单链环状 I．1．1 植物材料 植物受体番茄品种菜都六号购于山东省 DNA病毒。自1986年首次将烟草花叶病毒 (TMV)外壳蛋 寿光市金 田种苗有限公司。TYLCV病毒样品采 自山东省寿 白(coatprotein，CP)基因导入烟草培育出抗 TMV植株 以来， 光市，番茄植株上部卷曲黄化及矮缩等具有感染番茄黄花曲 利用病毒本身的基因导入植物获得抗病毒植株已成为抗病毒 叶病毒典型症状的叶片。 基因工程的重要手段。在番茄转基因抗病毒育种中，主要利 1．1．2 菌株与试剂 限制性 内切酶 lI、Eco911、 用病毒的外壳蛋白基因和复制相关蛋白(replication—associ— T4一DNA连接酶、DNAMarker均购 自MBI公司，TaqDNA聚 atedprotein，Rep)基因。 合酶、碱性磷酸酶购 自宝生物工程有限公司，植物基 因组 复制酶是指由病毒编码的，能特异合成病毒正负链RNA DNA提取试剂盒、凝胶快速纯化试剂盒、质粒小量提取试剂 的RNA聚合酶 ，其核心功能是合成全长的病毒基因组 RNA。 盒等均购自北京全式金公司。植物表达载体 pCAMBIA1340 、 在病毒编码的复制酶组分中存在多个保守序列 ，这些序列对 农杆菌LBA4440 由山东农业大学竺晓平老师惠赠。大肠杆 聚合酶的活性必不可少 。自1990年Golemboski等将TMV 菌(Escherichiacoli)DH5a、BL21由笔者所在实验室保存。琼