液相色谱同位素稀释质谱对寡核苷酸含量测定研究.pdfVIP

第27卷增刊 分析测试学报 V01．27 FENXICESHI ofInstrumental 2008年11月 XUEBAO(JournalAnalysis) Nov．2008 液相色谱同位素稀释质谱对寡核苷酸含量的测定研究 高运华，武利庆，王 晶，张玲，刘张岚 (中国计量科学研究院，北京100013) 寡核苷酸，是一类约有20个碱基对的短链核苷酸的总称，用于基因芯片、电泳、荧光原位杂交等 过程中DNA或RNA结构的确定，或者作为引物和探针用于PCR扩增反应，对目的核酸序列进行扩增 检验。此外其作为调控寡核苷酸可用于抑制RNA片段，防止其翻译成蛋白质，在抑止癌细胞活动方面 起一定的作用。寡核苷酸的质量和数量对基因芯片检测、原位杂交质量、PCR扩增效率具有显著的影 响。寡核苷酸的精确定量测量将为寡核苷酸相关产品的质量控制提供技术支持¨。1。本文探讨了和I用 过酶消解寡核苷酸单体组分而不需要使用寡核苷酸标准物质进行定量测量的方法。 1 实验部分 1．1 仪器与试剂 HPLC．MS 3k15，MJ FinniganLTQ，高速冷冻离心机Sigma 分析仪，海尔一20℃冰箱。 QS)。 1．2 实验步骤 1．2．1寡核苷酸样品的前处理取寡核苷酸样品1份，于4℃使其溶解，置于室温下平衡60min。吸 txL灭菌超纯水配制成100 取lO灿样品加入200灿PCR反应管中，然后加入90 IxL溶液。加入蛇毒 oC，消解60min。然后加入虾碱性磷酸酶0．005 磷酸一酯酶(50g／L)5U，37 u(1 U／mL)，37℃，消 解60min。样品置于4℃冰箱保存待测。 XTerra@RPl8 mm×150 1．2．2色谱分离与质谱分析色谱条件：Waters 3．5斗m，2．I mm；流动相A： 10 4．0；流动相B：甲醇；流动相组成：97％A一3％B；洗脱时间：20 mmoL／L乙酸铵，pH min；流速 0．2mL／min：检测器：LTQ质谱检测器；检测方式：选择离子扫描模式。 质谱条件：质谱仪喷雾电压：5．00kV，壳气流速：60．00arb，辅助气流速：6．00 arb，干燥气温度： 350．0 oC，离子源类型：ESI。 1．2．3样品测定取10汕经过处理的标准核苷酸样品溶液和待测寡核苷酸酶消解样品溶液进行色 谱一质谱测定。 2结果与讨论 2．1 核苷酸标准物质与同位素标记核苷酸样品的色谱分离分析 按寡核苷酸样品中序列组成比率和OD260／OD280测量的含量值配制4种脱氧核苷一磷酸标准物质 先后加入蛇毒磷酸一酯酶和虾碱性磷酸酶进行酶解处理，酶解样品过0．2Izm滤膜后进行色谱～质谱分 析，色谱分析图见图l。由图l可知，在本文色谱条件下4种脱氧核苷酸标准物质，4种同位素标记核 苷酸样品酶解产物(核苷酸标准物质和相对应的I—j位素标记核苷酸样品色谱分离条件一致)可以很好地 min，dG／LdG：8．90min，dA／LdA：15．34 分离，出峰时问依次为dC／LdC：3．50 min，dT／LdT响应太 基金项目：国家基础