大鼠椎间盘突出及其突出后重吸收模型的建立和研究.pdfVIP

大鼠椎间盘突出及其突出后重吸收模型的建立与研究 Aratmodelofdischerniation resorption spontaneous 刘锦涛姜宏 上海中医药大学 苏州市中医医院骨科 腰椎间盘突出症是临床常见病多发病，据一般统计，当临床诊断为腰椎间盘突 出症后只有10％,--,20％的病人需要手术治疗川。多数腰椎间盘突出后可经非手术疗法 得到缓解或治愈121。近年来，国内外学者通过影像学的追踪观察，发现部分腰椎间盘 突出可以被自然吸收。而椎间盘突出后自然重吸收过程涉及到一系列的复杂的形态 学、生化指标的改变。这一复杂过程需要经过合适的动物模型去正确分析验证。大 鼠是实验过程中常用的动物，其有实用经济，来源广泛的特点。本试验建立一种利 用大鼠模拟人的椎间盘突出后自然重吸收过程的动物模型。 一、材料和方法 (一)荬验动晌 选取清洁级3月龄SD雄性大鼠14只，体重3509左右，由中科院实验动物中心提 供。随机分为对照组和实验组。动物实验环境：清洁级。 r二J建立动物模型 1．手术操作步骤实验组：采用氯胺酮(O．8ml／只)腹腔注射麻醉，麻醉成功 后，剃刀剃去背部及臀部体毛，橡皮筋扎住尾部。常规消毒，无菌条件下，每只切 取尾椎椎间盘2个，包含上下软骨终板。用针刺破上下终板，使髓核暴露，造成游 离或破裂状态。用7号手术线“米”型包绕椎间盘，放入生理盐水器皿备用。然后无 菌条件下后正中线后路切开背部皮肤、肌肉，暴露脊椎，去掉椎板。将取出尾追椎 间盘放入，逐层缝合。对照组：成功实施麻醉后，无菌条件下后正中线后路切开皮 肤、肌肉，暴露脊椎，去掉椎板，放入线团，逐层缝合。 2．组织学观察及免疫组化分析动物30天后处死，由于实验组每只大鼠埋植两个 苯透明，石蜡包埋固定、切片。做HE染色观察形态改变及免疫组化分析，观察 取正常尾椎椎间盘一个，包埋切片(方法同上)之后，做HE染色及免疫组化检测 VEGF,TNF--。o。 3．流式细胞仪检测T，B细胞动物30天后处死，实验组取埋植的另一椎间盘， 用眼科剪剪碎，放入研钵轻度研磨，用10mlPBS反复冲洗组织，经过匀浆机反复震 荡混匀，透过细胞滤网滤去组织将液体导入离心管内，取3ml放入放入离心机导管 Anti 以2000rpm／5秒，离心15分钟，弃上清，经过一系列处理后，加入抗体FITC rat Mouse CD4，FICT 1，k IgGIsotypecontrol(美国BioLegend)。分别检钡OTh(T辅助细 h(T辅助细 胞)，B细胞。计算机数据处理软件Lysis(美国B．D．公司提供)分析得出T 72 胞)B细胞的含量比例。对照组取出背部埋线肌肉周围组织，用眼科剪刀剪碎，放 入研钵轻度研磨，用10mlPBS反复冲洗组织，透过滤网放入离心管内，每个椎间盘 组织取材3ml用作流式细胞仪检测．用做对照。(排除由线团引起的免疫反应)。 4．统计分析用SPSS13．0统计软件包分析数据，采用单因素方差分析对各组之间 的差异进行检验。数据以x-J：s表示，检验标准P0．05，P0．01。 二．结果 r一．J组织学观察 1．取材时模型组椎间盘组织明显的缩小或皱缩，与硬脊膜有不同程度的粘连。 但由于丝线包绕界限比较清楚，容易剥离。 2．HE染色对照组椎间盘(即正常状态下椎间盘)。HE染色片在光镜X100倍 下，可见中心为髓核区，胶原纤维排列呈网状，髓核细胞较小，呈圆形，散在其 中；外周环绕的是纤维环区，大量胶原纤维散在排列，纤维环细胞为长长梭形状， 核呈长柱状，染色深。模型组：纤维环板层结构变化不大，排