生化仪器分析终稿.docVIP

分子能级与光谱的关系,有几种动能和能级,哪一种不能产生分子光谱?Why?1平动能→平动能级;转动能→转动能级→分子的转动光谱;振动能→振动能级→分子的振动光谱;电子运动能→电子运动能级→分子的电子光谱.2由于平动能级只是在同一能级上运动,所以该能级不产生分子光谱. 紫外—可见光分光光度计基本构造有哪几部分?有哪些主要的技术指标?1基本构造有5部分:辐射光源.单色器.吸收池.光电检测器.显示器2主要技术指标:波长范围.波长精度.波长的重现性.光度的测量精度.光度测量的重现性.杂散光.分辨率. 洗脱方式有几种?各自有何特点?1一步洗脱:实验室常用的洗脱方式,用一种浓度的洗脱剂进行洗脱,适用于组分比较单一或者被分离组分非常明确,吸附的量占主要部分2分布洗脱:采用不同浓度的洗脱剂或采用不同种类的洗脱剂进行洗脱,适用于两种以上的组分且吸附数量较少,分离度差别大的组分3梯度洗脱:采用浓度连续变化的洗脱剂进行洗脱,适用于多种组分且吸附数量较多,分离度差别较小,分离度差别较小,上述两种方法难以分离的组分 IEX中缓冲溶液的选择与选择原则1选择:缓冲容量: 在缓冲容量满足的前提下尽量降低缓冲液浓度;PH值:缓冲液PH值与等电点至少相差1个单位;离子强度:尽可能采用低离子强度;保护剂:某些特殊样品需加保护剂保持不稳定性质2选择原则有利于样品的稳定;有利于样品的吸附和洗脱;有利于样品的后处理;考虑缓冲液是否有毒性;考虑是否有热源 上样的注意事项?1上样量:通常上样量不超过交换容量10%~20%2样液浓度:浓度不宜过高,若较高样液浓度,最好先用缓冲液进行稀释再上样3离子强度:样液离子强度不能过高,若高采用较高离子强度的缓冲液,若低采用低离子强度的缓冲液上样4流速:对浓度低的样液流速可快一些,对高浓度的样液流速可慢一些 紫外—可见分光光度计与荧光分光光度计在结构上的不同?1紫外~结构:辐射光源.单色器.样品池.检测器.显示器荧光~结构:激发光源.激发单射器.样品池.发射单色器.检测器.显示系统2差异:①测光角度不同,荧光分光光度计的检测器的位置与入射光源的方向成900角,其对面的背景为暗背景,紫外分光光度计检测器的位置与入射光源方向平行,其对面的背景为亮背景②单色器位置不同,荧光~设在检测器前面,样品的发射光经单色器分光后进入检测器,可以除去样品发射以外的辐射,使分析更有专一性,紫外~设在样品池前面,光束先进入分光器分光后再进入样品池③比色杯不同,荧光~使用的样品池是四面透光的样池可作为紫外用,紫外~两面透光的样池,不能作为荧光~用 SDS电泳条件的选择1.缓冲液的选择:在被分析的蛋白质稳定的pH范围内,凡是不与SDS发生相互作用的缓冲液均可使用,但也要选择对蛋白质条带的分离和电泳速度有利的缓冲液.样品缓冲液要求低离子强度,均采用凝胶缓冲液的1/10,而SDS含量应高于凝胶缓冲液2.凝胶浓度的选择:不同相对分子质量范围的蛋白质应选用不同的凝胶浓度3.样品的处理:a还原SDS处理:在样品溶液中加入SDS,还原剂β-ME,DTT在100℃煮3~5min.b带有烷基化作用的还原SDS处理:碘乙酰胺的烷基化作用可以保护SH基不易再氧化.c非还原SDS处理:在测定一些生化样品如体液.血液.尿液时,不希望破坏免疫球蛋白的四级结构,一般只用1%SDS而不加还原剂在100℃煮3min,这种情况下二硫键未断裂,蛋白质没有完全去折叠,但不能用来测分子量 SDS原理1.SDS的作用 SDS是一种阴离子去污剂,它能破坏蛋白质分子内和分子间的非共价键,并结合到蛋白质分子上,使分子去折叠,破坏蛋白质分子内的二级和三级结构,使蛋白质变性而改变原有的空间构象2.解聚作用 β-巯基乙醇和二硫苏糖醇(DTT),作为一种强还原剂,它的作用是使蛋白质分子中半胱氨酸残基之间的二硫键打开并不易再氧化,在样品和凝胶中同时加入SDS和还原剂DTT后,由于还原剂作用,蛋白质分子被解聚成多肽链,形成单链分子3.蛋白质-SDS复合物 解聚后多肽链的氨基酸侧链与SDS充分结合,形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物.由于SDS带有大量负电荷,大大超过了蛋白质分子原有的净电荷量,从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异.SDS与蛋白质结合后,还引起了蛋白质构象的改变,蛋白质-SDS复合物在水溶液中的形状近似雪茄烟的长椭圆棒,不同相对分子质量的复合物棒状物短轴长度一样,长轴长度与分子量大小成正比.这样复合物的迁移率不再受蛋白质原有电荷与形状影响,只与分子量有关.4.聚丙烯酰胺凝胶的分子筛效应 不同相对分子质量的亚基受阻程度不同,表现出不同的电泳速度,这样利用凝胶的分子筛效应就把同一样品中不同大小相对分子质量的蛋白质亚基分离开. AC中洗脱方式①一步洗脱:非选择性洗脱方法,应用于高度特异性吸附剂的结合