骨髓源性肝干细胞体外扩增后自体移植的临床应用及研究.pdfVIP

缺少供体以及排斥反应，使其在临床上的应用受到限制。相比之下，干细胞移 植不仅来源广泛，创伤性小，而且干细胞的免疫源性低，其排斥反应远远低于 肝脏移植。干细胞移植不但可以用于晚期肝病，也可以用于重症肝病的治疗， 前景广阔。骨髓细胞可以分化形成肝细胞的特定干细胞群，被称之为骨髓源性 marrowderivedliverstemcells 肝干细胞(bone BMDLSC)，为肝脏疾病治疗提供 了新思路和新手段。尽管肝干细胞的特征性表面标记至今没有发现，但Lagasse 在酪氨酸小鼠研究中发现C．kit+Sca+Lin。细胞向肝细胞分化的能力比较强【l】，而后 唐等在放射性小鼠肝损伤修复更是进一步指出C．kit+Lin’(CDl17)是一群富含 BMDLSC的骨髓干细胞群12J，本小组前期研究已经证实，骨髓中CDll7阳性细胞 和CDl84FB性细胞都具有较强的肝干细胞潜能【3巧】。与其它类型的骨髓干细胞类 似，c-kit+Lin’细胞的数量有限，难以满足未来应用的需要。 本实验利用非连续Percoll密度梯度离心对人自体骨髓进行分离，分离后的各 界面层的细胞进行流式检测CDll7阳性细胞和CDl84阳性细胞的比例，确定比例 最高的细胞群后，从新鲜骨髓中获取富含CDll7阳性细胞和CDl841jEI性细胞的组 分用于后实验。然后将细胞在体外培养扩增0天、7天、14天，扩增方案采用含 10％自体血清的高糖DMEM培养基体系中和无血清的高糖DMEM培养基体系中 加入不同浓度的促肝细胞生长素(HGPF)、促血小板生长素(TPO)和白细胞介 中文摘要 素3(IL．3)，分别培养摸索最佳培养基体系，经最佳培养基体系培养后用流式细 胞计数法测定扩增细胞中CDl17EEl性细胞和CDl84FH性细胞的数量变化，用实时 定量PCR法检Nc．MetRNA表达的变化。总结出人自体骨髓来源肝干细胞体外扩 增后自体移植的技术方案，为将来临床上进行骨髓来源肝干细胞体外扩增后自 体移植治疗肝脏疾病奠定基础。 【材料和方法】 l、密度梯度离心结合流式细胞术提取骨髓来源肝干细胞 1．1Percoll不连续密度梯度沉淀法分离骨髓细胞群 g／m1)、50％(1．067g／m1)、40％(1．056g／m1)、30％(1．043g／m1)四个密度费联 系梯度，分离出4个有核细胞组分。 1．2流式细胞仪检测各个细胞组分中CDll7阳性细胞核CDl84阳性细胞比例 细胞计数后，取l×106个细胞置于1．5ml EP管中，离心调整为1009l体积， 避光环境下，各管分别以PE标记抗人CDl17直接抗体和APC标记抗人CDl84 性细胞比例。 2、人骨髓源性肝干细胞体外扩增方案的探讨 2．1密度梯度离心结合流式细胞术分离富含CDl17+细胞群 采集人体骨髓10-20ml，使用percoll作为分离液，分成50％(1．067g／m1)、40％ (1．056 g／m1)两种浓度，过滤除菌后，由下至上按密度递减置于离心管中，将 预处理后的骨髓细胞悬液缓慢加至分层液上，4009离心力，离，t=l,25～30分钟，可 间的细胞层)的细胞层为目的细胞群。 17+人自体骨髓来源肝干细胞 2．2体外扩增富含CDl 2．2．1确定细胞培养密度 骨髓细胞悬液，经密度梯度离心后，留取Percoll浓度为50％与40％之间层 ，于24孔板上培养14天，， 2mg／ml注射用盐酸头孢甲 2．2．2确定细胞扩增最佳体系 培养基为DMEM培养基(高糖，2mg／ml注射用盐酸头孢甲肟)，分别添加 细胞悬液经密度梯度离心后，留取Percoll浓度为50％与40％之间层的细胞群， 于24-孑L板上，随机分成138份按确定的最佳细胞密度(细胞浓度为2．50×106／m1) 分别加入到上述各培养基组合中，共计128孑L，另外10份加入到随机培养基组合 中，作为计数对照孔，培养14天，根据生长情况传代。分别记录7天和14天细胞 数量。 2．3最佳体系扩增后检测 配置最佳培养体系：DMEM培养基(含10％自体血清，4099／mL注