黄芪总黄酮的提取技术.docVIP

黄芪总黄酮的提取技术 　　【摘要】优选黄芪总黄酮的提取工艺。 　　【关键词】黄酮;提取工艺 　　酶技术应用于中草药有效成分的分离提取取得了不少新的成果，尤其应用纤维素酶可破坏细胞壁的致密结构，加速药用有效成分的溶出，提高药用有效成分的提取率。酶解过程的实质是通过酶解反应促进传质过程。纤维素酶是一组能够降解纤维素生成葡萄糖的酶的总称。纤维素是黄芪细胞壁的主要成分，亦是胞内黄酮等大分子溶出的主要屏障，利用纤维素酶水解细胞壁，利于胞内成分溶出。 　　1仪器与试剂 　　1.1仪器:HH-6恒温水浴锅（江苏金坛市宏华仪器厂）；RE-52CS旋转蒸发器(巩义市英峪予华仪器厂)；予华牌循环水真空泵(河南省巩义市英峪予华仪器厂)；UV1101紫外/可见分光光度仪(上海天美科学仪器有限公司)；AY120电子分析天平（日本岛津公司）；KH-400KDB型高功率数控超声清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司）；摇摆式高速中药粉碎机(大德中药机械有限公司)。 　　1.2试剂:乙醇（无水乙醇）；5%亚硝酸钠；10%硝酸铝；4%氢氧化钠；乙酸（冰醋酸）；无水乙酸钠；芦丁对照品（中国药品生物制品检定所，批号:050923）,黄芪购自广州致信中药饮片有限公司，纤维素酶(活性单位≥15U／mg)由上海伯奥生物科技有限公司提供。 　　2方法与结果 　　2.1黄芪总黄酮成分提取:称取纤维素酶8mg，用pH=4.5的HAc-NaAc缓冲液10ml混合后与1g黄芪粉末（过50目筛）混合均匀，在30℃下处理1h后加95％的乙醇20ml，在70℃下浸提1h过滤，用20ml体积分数85％的乙醇洗涤残渣过滤，合并滤液，回收乙醇，残渣溶于质量分数为85%的乙醇，定容至25ml，精密吸取1ml于25ml的容量瓶中，30%乙醇定容,得供试品溶液。 　　2.2黄芪总黄酮含量的测定 　　（1）芦丁对照品溶液的制备:准确称取于芦丁对照品10mg,置于50ml容量瓶中,加30%的乙醇30ml,超声使之溶解,冷却至室温,并稀释至刻度,摇匀,得浓度为200μg/ml的芦丁对照品溶液,冷藏,备用。 　　(2）吸收波长的选择:对照品测定波长的确定：取对照品溶液1ml，按标准曲线项下的方法进行，在400～700nm波长范围内扫描，结果在500nm波长处为最大吸收。样品测定波长的确定：取样品的乙醇提取液1ml，按标准曲线项下的方法进行，在400～700nm波长范围内扫描，结果在500nm波长处有最大吸收。 　　2.3黄芪中总黄酮提取率的测定:取黄芪中总黄酮提取液用紫外分光光度计于500nm下测出吸光度A代入以下回归方程式及下列公式，计算出黄芪中总黄酮的提取率。提取率（%）=（C×V×10-6）W，式中V为定容体积（ml），W为黄芪药粉质量（g），C为黄芪提取液浓度（μg/ml）。 　　2.4单因素实验及正交实验酶法提取的整个工艺分为酶解和浸提两部分，准确称取黄芪1g，加入缓冲溶液和一定比例的酶，黄芪经酶解后在相同的条件下浸提，过滤，按标准曲线方法测定吸光度。 　　(1）考察酶解温度对总黄酮提取率的影响:称取纤维素酶8mg，用pH=4.5的HAc-NaAc缓冲液10ml混合后与1g黄芪粉末（过50目筛）混合均匀，分别在30，35，40，45，50，55℃下处理1h后加95％的乙醇20ml，在70℃下浸提1h过滤，用20ml体积分数85％的乙醇洗涤残渣过滤，合并滤液，回收乙醇，残渣溶于质量分数为85%的乙醇，定容至25ml，精密吸取1ml于25ml的容量瓶中，30%乙醇定容，按标准曲线操作测定总黄酮含量。由于一般纤维素酶的活性多在40～60℃较好，因此考察酶解温度为30，40，50，60，70℃对黄芪中总黄酮提取率的影响。 　　(2）考察酶解时间对总黄酮提取率的影响:称取纤维素酶8mg，用pH=4.5的HAc-NaAc缓冲液10ml混合后与1g黄芪粉末（过5目筛）混合均匀，在45℃下分别处理30，60，90，120，150min后加95％的乙醇20ml，在70℃下浸提1h，过滤定容方法同上。随着酶解时间的延长，总黄酮的提取率也随着提高，当酶解2h即可达到最佳效果，在2h之前，延长酶解时间可明显提高总黄酮提取率，但在2.5h实验时的总黄酮的提取率仅比2h略高，说明酶解已经基本完成，没有再增加酶解时间的必要。 　　(3）考察酶用量对总黄酮提取率的影响:分别称取纤维素酶4，6，8，10，12mg，用pH=4.5的HAc-NaAc缓冲液10ml混合后与1g黄芪粉末（过5目筛）混合均匀，在45℃下处理1h后加入95%的乙醇20ml，在70℃下浸提1h。过滤定容方法同上，在酶用量在8mg之前，随着酶用量的增大，总黄酮的提取率逐步提高，酶用量到8mg之后，总黄酮的提取率上升趋势不明显。纤维素酶用量对酶解用一定的影响