高质量枣树基因组DNA提取方法地研究.pdfVIP

高质量枣树基因组DNA提取方法的研究 高质量枣树基因组DNA提取方法的研究 王永康¨王永勤2田建保1樊新平1李登科1隋串铃1黄丛林2 (1山西省农业科学院果树研究所。太谷030815；2北京市农林科学院北京农业生物技术研究中心．北京100089) 摘要：主要针对枣树组织中多糖严重干扰基因组DNA提取质量的问题，本研究比较了常规CTAB 法、TE3D法和改良CTAB法3种方法的处理效果。结果表明：常规CTAB法提取DNA难以去除植 物组织中的多糖类杂质；TE3D法提取DNA多糖杂质少，但产率低，易降解，褐化严重；而改良 1—1左右)，产率高，可达120lIDNA·91(新鲜组织)，无 CTAB法提取DNA量大(1000ng·|I g 足实验要求。并进一步对改良CrAB法的关键步骤作了具体分析讨论。 关键词：枣；DNA提取；改良CTAB法 枣原产中国，栽培历史悠久，品种资源丰富，为我国特有果树资源，是一种重要的经济 林树种，深入开展枣树分子生物学研究具有重大意义。枣树各种组织中蛋白质、酚类、单宁、 色素及多糖含量较高，尤以生长旺盛的幼嫩组织为甚。植物组织所含的蛋白质等诸多物质严 重影响基因组DNA提取质量，很容易出现DNA呈黏稠状的现象，枪头难以吸取，各类酶对 求高质量的DNA，其质量高低关系着实验的成败【ll。如何提取高质量的DNA是有效开展枣 树分子生物学研究的基础和关键。本实验通过不同方法提取枣树DNA的效果比较，分析讨 论了实验过程中的关键步骤，旨在寻求高质量枣树DNA有效提取方法，进而对中国枣种质 资源开展准确的分子鉴定评价。 1材料与方法 1．1材料 供试材料为梨枣、壶瓶枣、中阳木枣3个品种，均采自山西省农业科学院果树研究所国 家枣种质资源圃。取幼嫩叶片组织，放冰壶中带回实验室，液氮速冻后一70℃冰箱保存备用。 1．2试验处理 新鲜组织。品种编号及处理见表1。 1．3提取方法 1．3．1常规CTAB法 M 参照ClarkS的《植物分子生物学实验手册》中方法【2】，人们已经利用该方法成功地从 多种植物中分离得到了相对分子质量较高的DNA，但纯度不一。 ‘通讯作者Corresponding author；E-mail：wangrkmerry@sina．con3。 126 ji二果研究进展(4) 1．3．2 TE3D法 TE3D法通常用于提取植物RNA，但同时也可获得DNA。本试验在Karin phen01．TE3D溶液。加4001al氯仿，异戊醇(24：1)，2501al 500～14 匀，待组织融化后，在15～30℃温育5min。12 12000—14 乙醇沉淀DNA。用70％乙醇清洗沉淀，干燥沉淀，加入无菌水201al溶解。 1．3．3改良CTAB法 常规CTAB法应用于一般植物具有较好的效果，但对于某些特殊植物材料，必须根据其 具体特点采取不同的改进措施才能能得到更好的效果【45】。本方法根据枣树特点，在常规 mol·L叫Tris—HCI 中加4％B一巯基乙醇；细胞膜破裂之前用CTAB—free缓冲液(0．2 pH8．0， mol·L-1 0．05mol·L～EDTA，0．25 mol·L_1 的含量：抽提过程中加1／10体积CTAB／NaCl混合液(10％CTAB，1NaCl)；沉淀 DNA前加入1／2体积5mol·L1NaCl溶液。 1．4DNA质量初检 EB)电泳， 取41alDNA原液加lgl上样缓冲液混匀，0．8％琼脂糖凝胶(含0．5lag·ml_1