根癌农杆菌介导ppIP基因转化短芒披碱草地研究.pdfVIP

“2006全国博士生学术论坛一中国生物多样性”论文集 根癌农杆菌介导ppIP基因转化短芒披碱草的研究① 李达旭②赵建黄敏李力张艺刘素君陈飞杨志荣张杰邑 四川I大学生命科学学院生物资源与生态环境教育部重点实验室，成都610064 and 摘要：以短芒披碱草种子的成熟胚、下胚轴和幼叶为外植体，MS(MurashigeSkoog)为基本培养基，添邪2，4-二氯 诱导的最适培养基为MS培养基，最佳的激素组合为2，4-D mg／L。不同外植体来源和不同激 6．0mg／L和Kinetin(KT)0．05 索组合及浓度将产生不同类型的愈伤组织，其中黄白色，颗粒状易脆裂的愈伤组织才能够再生植株，而水样无明显结构的愈 伤组织则只能诱导生根，不能再生出植株。在愈伤组织的诱导和继代培养时，添加一定数量的水解酪氨酸．可以改善愈伤组 织的质量，提高愈伤组织的分化能力。从成熟胚诱导的愈伤组织分化能力最强，可以达到54％左右。最佳的分化培养基是1／2MS 2．0 0．5 2．0 0．5 培养基添加6一BA mg／L和NAAmg／L。共培养后的愈伤组织转接到MS基本培养基，并添加6-BAmg／L、NAA mg／L和60mg／L潮霉素，进行愈伤组织的分化和筛选。对分化形成的抗性植株进行PCR-southern 析，获得了一批抗虫转基因新材料。转基因材料经抗虫饲喂实验，其蝗虫致死率达到23．7％，与非转化材料相比，杀虫效 果显著。同时研究了愈伤组织类型及生理状态、农杆菌浸染液的浓度、共培养温度及时间和培养基成分等因素对农杆菌遗传 转化的影响，通过对这些条件的优化，建立了农坪菌介导的短芒掖碱草程序化转基因方案。 关键词：短芒扳碱革；愈伤组织再生：印伊基因；农杆菌转化 短芒披碱草(E]ymus 生植物。该品种具有抗逆性强：产草量高：利用年限长和饲草品质优等优点，现已成为Jll西北牧区建设高 产优质打贮草基地的主要栽培草种。该优良牧草是蝗虫的主要取食对象，蝗灾己成为该优质牧草推广应用 的王要障碍。抗虫转基因技术的发展，为解决蝗虫危害提供了有效途径。但从文献报道来看，目前报道的 转基因禾本科牧草大多数来自于直接转化”1。，只有少部分禾本科牧草通过农杆菌介导获得成功“1“。主要 原因有二：其一是单子叶植物不是农杆菌的宿主…。，在常规条件下不易实现农杆菌的T-DNA对单子叶植物 的遗传转化：其二是绝大多数单子叶植物的组培再生体系不易建立，这更增加了农杆菌介导转化的难度。 随着根癌农杆菌转化机理的认识“2‘23】和单子叶植物组培技术的发展【5_2“纠_引，通过农杆菌介导的遗传转化 已成为多数研究者的首选方法，因为农杆菌介导的遗传转化有操作简单，转化率高，拷贝数低，能稳定遗 传等诸多优势12“。目前，单子叶植物的转基因技术和方法已基本成熟，因此许多优质的牧草通过基因转化， 提高其抗虫和抗逆能力已成为可能。 本研究利用短芒披碱草E]ymus 经过条件优化，建立了高效稳定的短芒披碱草愈伤组织再生系统。并利用本实验室克隆的类产碱假单胞菌 (Pseudomonss 霉素筛选后获得了具有杀虫能力的转基因植株。通过农杆菌介导将杀虫蛋白基因PPIP转入优质牧草短芒 披碱草(EJymus 方法，同时表明，通过优化转化条件，可以实现农杆菌介导的一些较难转化的单子叶牧草的遗传转化。 1材料和方法 1．1外植体 短芒披碱草(Elymusbreviaristatus)成熟种子，由四川省草原研究所提供。 1．2菌株和质粒 q国家“十五”科技攻关转基因专项(030451012JY03．B31)资助． 4男，1969年生，博士，研究方向：现代遗传与生物工程，E．mail：Idxl36@126．corn @通信作者．联系电话：028- 179of337 Page “2006全国博士生学术论坛一中国生物多样性”论文集