1.虎纹捕鸟蛛毒素-Ⅰ生物素标记与受体分析%3b2.过甲酸氧化辅助酶解在质膜蛋白质组学中应用.pdf

摘 要 1虎纹捕鸟蛛毒素一l的生物素标记与受体分析 慌纹撼鸟蛾蛛℃Se2e瓣◇eos激i凌《固r嚣i专是◇e乏◇黪娃s)蠢“孵疆武跫分诮 在我国两南部LlJ区的一个蜘蛛新种。它的柑毒中含有多种活性成分， 其巾研究得比较深入的多为多默神经毒素。虎纹摘鸟蜘蛛毒素一王 类神经毒素。它出33个氨基酸残基缌戒，其中的§个Cys形成3对 二硫键，能可逆性阻断小鼠膈神经膈肌接头的传递，作用位点在突触 前膜。膜片钳分析提示它是一种N型钙离子逶道阻断荆。 为了对HwTX—I在细胞质膜上的受体蛋白进行分离纯化和鉴定， 获得关于}{WX—I作用机理的更直接的证据，本研究首先优化了 H孵X一王生物素标记的实验条件，分析了生物素标记对H婀X一王活性的 影响，然后利用基于生物素一亲和索系统的亲和纯化和蛋白质组学分 事厅技术，对H骶卜I在大鼠膈神经～龋胍突触细胞矮膜上的受体蛋自进 行了分离纯化与鉴定。标记实验结果表明当生物素标记试剂与HwTX—I 的摩尔比为2：圭时，大部分珏溪罩X～王分子只被标记上一个生物素分子， 标记率达42％。质谱分析和电生理实验表明该生物素基团标记在 嚣瓣X一王的己ys董3上，标记后不影响嚣孵卜王的生理活性。亲和纯化出 来的受体蛋白组分经SDS—PAGE分离、胰蛋白酶酶解和质潜鉴定，我 稍鉴定到了几静瀚霉X一壬的可能受体。 关键词：虎纹捕鸟蛛毒素一I，受体，生物素，亲和素，亲和纯化， 高效液栩色谱，质谱 2过甲酸氧化辅助酶切法在质膜蛋白质组学中的应羯 质膜蛋白在许多生物学过程中起重要作用，是许多药物的作用靶 标。细胞须膜蛋自质组研究正成为蛋自质组学的研究热点。然而由于 整合膜蛋白低丰度和疏水的性瑷，使得其狠难被分析和鉴定。在蛋白 质组学分析过程中，疏水性肽段和跨膜肽段常常很难被鉴定到，这样 就降低了疆白总的覆盖率和蛋自被鉴定的可靠性。 本研究报道了一种膜上酶解耘策略，用于膜蛋自质的鉴定。该策 略的特点是引入了过甲酸氧化处理(PAOT)。由于过甲酸试剂能将半 胱氨酸残基和甲硫氨酸残基分别氧化为半胱磺酸和甲硫氨酸砜，这使 得蛋童的疏水性大大降低，增加了疏水性肽段的酶切和检测效率，这 非常有利于分析鉴定疏水性强的蛋白e以人类CNEl细胞系为材料， 我们比较了PAoT辅助酶解与另外二种常用的酶解方法：胰蛋白酶／ 胰凝乳蛋囊酶酶解和甲醇酶解站结果表明，甲醇酶解法鉴定到?2个 整合膜蛋白，其中平均疏水值大于O的蹑白数为3l；胰蛋白酶／胰凝 乳蛋白酶酶解法共鉴定到59个整合膜爱白，其中平均疏水值大于O 的蛋自数为40个；P鹪墨法共鉴定到王0王个整合膜蛋白，其中平均蔬 水值大于O的蛋鼠数为67个培因此，比起其它两种传统的方法，过 甲酸氧化辅助酶解方法能鉴定到更多的高疏水性多跨膜区蛋白质，更 适合膜蛋离质组分析。 关键词：整合膜蛋白，蛋白质组学，过甲酸氧化，质膜，质谱 ll ABSTRACT l Biotin and of labelingreceptoranalysis Huwe虢toxin。王 TheChinesebird 纛is专ri{)t琏edin囊e ofYu稚稳鑫筏黼d south◇f hiily鑫l譬as G疆菇ngxl；魏穗e is idel娃i最ednew crudeVenonl◇f China， a芏Iecent垃 species．1’he of wim of O．办“w删dcontainsa mixture compoundsdif．ferent够pes