酶法制备低分子量肝素与其活性研究.pdfVIP

酶法制备低分子量肝素及其活性研究 刘亚梅何书英吴梧桐+(中国药科大学生命科学与技术学院，江苏南京210009) sc 摘要：用肝素酶I(heparinaI，EC4．2．2．7)对肝素进行控制性降解，分别在反应 16，32，48h终止反应，超滤离心粗分级后，用Bio-GelP6低压柱色谱分离纯化，得到3 a 组不同分子量范围的肝素寡糖混合物。用生色底物法和羊血浆法测定抗xa活性和抗II 活性。不同反应时间得到的肝素寡糖的抗xa和抗IIa活性分别为82．4／40．3、21．5／11．8 a／抗II 和5．6／4．5IU／mg，其抗x a活性值分别为2．04、1．82和1．24。结果表明降解16h 所得寡糖可供制备符合小分子肝素药物质控要求的产品。 关键词：肝素；肝素酶；低分子量肝素；抗凝 1寸4连接的重复二糖单位(2-0一硫酸一Q也一艾杜糖醛酸．(1_÷4) 肝素是(Heparin，HP)【}J ．6一O一硫酸一2一N一硫酸一Q-D．葡萄糖胺)组成的r亩度硫酸化的线性多聚糖，在机体内能与多种 蛋白质相。巨作用而具有多样性牛物功能，临床上肝素主要用于抗凝溶栓。低分子毽肝素足由 肝素化学或酶降解得到的寡糖断，具有较强的抗血栓和较低抗凝血{舌-阽。4i同大小的寡糖 』|．断能与刁i同贷白质|大|r的相巨作用而显现不同的生物学功能。女f16糖及6糖以卜-的寡糖具有 抗血管平滑肌(VSMC)增生的活。陛，而在抗凝中发挥关键作用的5糖则只具仃很低的抗 VSMC增生作用。聚合度8～10的寡糖”断能抑制碱。m成纤维细胞和盐水介导的血管生成。聚 合度为14～16的寡糖片断能抑制血管内皮生长因子165介导的血锊牛成。本研究用肝素酶I I，EC4．2．2．7)对肝素进行控制，肚降解，通过低压柱色谱分离纯化，得剑3组4i (heparinase a／抗IIa活性比。 同分j：量范围的寡糖片断，并研究其抗凝i舌。陀和抗X 1．材料与仪器 1．1材料 I，EC 4．2．2．7，术源于 肝素钠(常州生化』‘，180U／mg)，肝素酶I(heparinase Flavobacterium 公司产品，依诺肝素(德国安万特公司)，Bio—gelP6(Bio—Rad CBS34．47均为法国Stago公司产品，Tris、EDTA等试剂均为国产分析纯。 1．2仪器 SBS一100数娃恒温水浴锅(卜海申腾生物技术订限公司)，HL一2恒流泉(上海沪西分析 仪(北京六一。仪器厂)，夹心』I=乖肯板电泳楷(北京人一‘仪器』‘)，MWCO为lOkD的超滤离心 B 管(Bio—Rad公t．J)，LYOI，AB 器／‘)，w}{一3微掣漩涡混合仪(f：海沪鹏)，752紫fib)’己栅分光光度计(上海第■分析仪器厂J)。 2．方法 2．1聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE) 盯素寡糖混合物刷双蒸水配成5rag／hal，再与等体积40％蔗糖混匀配成Jj样液，溴酚蓝 作指示剂。电泳胶浓度采用22％的分离胶JJlJ5％的浓缩胶，150V电泳1h后，渊电压为200V 继续电泳1．5h。一卜样链为10～20pl，染色川O．25％阿利半蓝，染色0．5h，脱色朋2％醋酸脱 至彳亍景无色。 1 93 2．2』jl：崇的珂每f0翠反J、V 酶解小试确定降解条件：取一‘芝I二7争i式箭放入3()。C的一阿温水浴锅【|1，力¨入 25mmoISaAc lOmmoICaAc：(pit7．0)的反心缓冲液1．990ml和盯素钠10mg，恒孙10min后， 』J【l入日|j鬃酶1分装液0．0125ml(含8．708mlU)，30℃，阿温反应。分别代反应8、16、24、32、 40、48h取十丫109l』Ii补』JIl胁0．0125 度的J|}‘袭寡糖，冈此选择16、32、48h终If：降解反戍。