太湖水体中藻蓝蛋白紫外-可见 吸收光谱特征分析.pptVIP

紫外- 可见分光光度法（UV-vis）是目前世界上历史最悠、使用最多、覆盖面最广的分析方法之一。它已在生命科学、材料科学、环境科学、农业科学、计量科学、食品科学、医疗卫生、化学化工等各个领域的科研、生产、教学等工作中得到了非常广泛的应用。它可作定性定量分析、纯度分析、结构分析；特别在定量分析和纯度检查方面，在许多领域更是必备的分析方法。 太湖水体中藻蓝蛋白的紫外-可见 吸收光谱特征分析 01 02 03 04 结论与讨论 实验部分 简述 光谱特征 简述 藻蓝蛋白（phycocyanin，PC）是藻类进行光合作用的重要辅光色素蛋白之一，由藻蓝胆素（PCB）和脱辅基蛋白中保守性半胱氨酸残基的巯基构成，主要存在于蓝藻、隐藻，以及部分红藻的藻胆体中。在环境监测中，特别是蓝藻水华频发的水域，藻蓝蛋白浓度能较好地表征蓝藻生物量，是水体富营养化及蓝藻水华监测重点关注的指标。紫外-可见分光光度法是藻蓝蛋白浓度定量分析的常用方法，其主要依据是藻蓝蛋白500~700nm的吸收光谱特性。 由于藻蓝蛋白为胞内蛋白，提纯工艺复杂，当前环境监测研究中藻蓝蛋白的提取多以反复冻融、超声破碎、化学溶胀等细胞破碎方法为主，藻蓝蛋白浓度的计算主要沿用Bennett、abelson等学者基于单一藻种纯化光谱建立的经验公式。然而，反复冻融等提取结果的纯化程度不高，获取的藻蓝蛋白吸收光谱常常受到其他物质组分的影响而与经过硫酸铵盐析、柱色谱层析分离的纯化光谱存在差异。吸收光谱是藻蓝蛋白结构分析、浓度定量计算的基础，对内陆湖泊水色遥感反演研究也具有重要意义。 样品采集 1 实验方法 2 实验部分 样品采集 于2011年5月19日、7月30日、8月20日、9月3日、11月12日在太湖布设采样点位开展野外调查，共采集75个水样用于实验分析。 铜绿微囊藻、鱼腥藻藻种来源于中国科学院水生生物研究所，在江苏省环境演变与生态建设重点实验室的无菌实验室进行培养。取对数生长期的铜绿微囊藻、鱼腥藻样品进行实验。 藻蓝蛋白标准品（p6161）购自美国sigma公司，提纯于螺旋藻。 方法 太湖水样和铜绿微囊藻、鱼腥藻的藻蓝蛋白提取使用反复冻融法。首先用GF/C玻璃纤维滤膜过滤样品，将附着藻体的滤膜放入冻存管中，同时加入0.05mol·L-1磷酸盐缓冲液于低温冰箱冷冻，然后室温避光解冻，如此反复冻融７次。解冻的样品以12000r·min-1速度离心10min，取离心后的上清液作为待测液。以磷酸盐缓冲液作为空白对照，使用岛津 UV 2450/UV 2550分光光度计测量吸光度。 对于标准品的配置和测量，sigma公司生产的藻蓝蛋白标准品0.5mg，加人25mL磷酸盐缓冲液使其成为20mg·L-1的标准溶液贮备液，装入棕色瓶中，于4℃保存。实验分析时将标准液取出并配制为10mg·L-1的标准应用液。以磷酸盐缓冲液作为空白对照测量吸光度。参照张运林方法，通过 GF/F玻璃纤维滤膜过滤水样、测量滤液吸光度，获取有色可溶性有机物（CDOM）的吸收数据，对藻蓝蛋白吸收光谱特征进行辅助分析。 藻蓝蛋白标准品的吸收光谱特征 01 单一藻种的藻蓝蛋白吸收光谱特征 02 太湖水体的藻蓝蛋白吸收光谱特征 03 光谱特征 由图１可知，藻蓝蛋白标准品250~800nm紫外-可见光范围共有三个吸收谱带：250~300,300~450和500~700。主吸收峰位于620nm，由藻蓝胆素中的四吡咯环引起，为藻蓝蛋白的特有吸收特征。250~300nm的吸收峰出现在278nm处，源于蛋白中芳香族氨基酸苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸的吸收。300~450nm的吸收峰位于345nm，主要由蛋白中二硫键的吸收引起。标准品的278，345和620nm的峰值比约为2:1:5。 图2中，铜绿微囊藻、鱼腥藻藻蓝蛋白吸收光谱在与标准品对应的三个谱带上有类似的吸收峰。由于藻种差异和提取纯度的影响，单一藻种的吸收峰出现位置和峰值比与标准品存在差异。铜绿微囊藻藻蓝蛋白的三个吸收峰位于255，336，619nm，峰值比约为7:3:4；鱼腥藻则出现在259，340，614nm，峰值比约为5：1:3。此外，铜绿微囊藻和鱼腥藻300~450nm 的吸收谱型不同。铜绿微囊藻300~350nm出现吸收峰，350~450nm的吸光度值递减；鱼腥藻340nm峰两端的吸光度值递减，但峰型不对称。 根据待测溶液500~700的吸收峰个数，可将太湖水体中藻蓝蛋白的吸收光谱划分为无峰型、单峰型、双峰型三类（图３）。各吸收谱类型包括的样点数量和日期见表１。 第一类是无峰型，即500~700nm间变化平缓，620nm附近未检测到藻蓝蛋白的吸收特征。